Цианобактерии являются важными филум фотосинтетических микробов, которые все чаще признаются в качестве полезных платформ для синтетической биологии и возобновляемых биотехнологий приложений. Поэтому важно разработать надежные методы для упрощения проектирования, клонирования и внедрения гетерологических ДНК в различные цианобактериальные виды. Таким образом, этот метод демонстрирует устоявшийся метод, называемый спряжением или трипарентальным спариванием для введения ДНК в цианобактериальные виды, которые естественно не трансформируются.
Спряжение было успешно выполнено в широком спектре цианобактериальных штаммов от одной клетки до многоклеточных нитевидных видов. Если вы пытаетесь этот метод в первый раз, пожалуйста, позаботьтесь, чтобы справиться как с вашим cyanobacterial и E.coli штаммов с осторожностью. Например, не центрифуга выше значений, приведенных в протоколе, и не вихрь.
Смешивание бактерий и цианобактерий может показаться странным для впервые пользователей. Мы надеемся, что, продемонстрировав процесс спряжения, мы поможем прояснить это. После строительства сборки уровня 1 выберите соответствующий вектор T-приемчика уровня.
Выберите соответствующую конец ссылку, чтобы ligate три премьер-конец заключительного уровня 1 сборки на уровне T позвоночника. Чтобы собрать одну или несколько сборок уровня 1 в уровне T, подготовьте смесь реакций с PBI1 и требуемым вектором конечных звеньей. Настройка программы теплового цикла и продолжить в соответствии с рукописью.
В первый день, расти цианобактериальной культуры путем создания свежей культуры Synechocystis PCC 6803 или Synechococcus elongatus UTEX 2973. С тепловой стерильной петли, соскребать клетки из топорной пластины BG-11 агар и поместить в 100 миллилитров конической колбы заполнены 50 миллилитров свежих BG-11 средних прививать. Поместите колбу в трясусь инкубатор с освещением, чтобы вырастить Synechocystis PCC 6803 клеточных культур при 30 градусах по Цельсию при 100 об/мин.
Для Synechococcus elongatus UTEX 2973 выращиваем клеточные культуры при 40 градусах Цельсия при 100 об/мин. Через один-два дня нарисуйте один миллилитр клеточной культуры и измерьте на спектрофотометре. Поглощение на OD 750 достигает 0,5 до 1,5.
На второй день прививите штамм помощнику MC1061 E.coli, содержащий векторы PRK24 и PRL528 в пяти миллилитров среды LB с ампициллином при концентрации 100 микрограмм на миллилитр и хлорамфеникол при концентрации 25 микрограмм на миллилитр. Расти при 37 градусах по Цельсию ночью при 225 об/мин в трясущимся инкубаторе. Затем прививают пять миллилитров среды LB, содержащей соответствующие антибиотики с культурой E.coli, несущей вектор груза уровня Т.
Выращиваем культуру при 37 градусах Цельсия на ночь при 225 об/мин в трясущимся инкубаторе. На третий день центрифуга помощник и груз E.coli ночных культур на 3000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта, не нарушая клеточные гранулы.
Вымойте гранулы, добавив пять миллилитров свежей среды LB без антибиотиков. Resuspend гранулы, мягко трубы вверх и вниз и центрифуги, чтобы удалить супернатант. Повторите этот шаг мытья три раза, чтобы удалить остаточные антибиотики из ночной культуры.
После последней стирки, повторное размещение гранулы клетки в два раза объем LB среды первоначального объема культуры. Затем объединить 450 микролитров напряжения помощников с 450 микролитров грузового штамма в двухми миллилитровую трубку и оставить при комнатной температуре. Далее подготовьте цианобактериарной культуры путем центрифугирования одного миллилитра цианобактериальной культуры при температуре 1500 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем отбросьте супернатант тщательно, не нарушая гранулы клетки. Вымойте гранулы четыре раза, добавив свежие BG-11 среды того же первоначального объема. Добавьте 900 микролитров промытой цианобактериальной культуры в 900 микролитров комбинированных штаммов E.coli в двухмилитровой трубке.
Смешайте культуры, мягко трубы вверх и вниз. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 30 минут для Synechocystis PCC 6803 или два часа для Synechococcus elongatus UTEX 2973. Центрифуга смеси при температуре 1500 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Удалите 1,6 миллилитров супернатанта и повторно посовелите гранулы в оставшийся супернатант. Поместите один 0,45 микрон мембранный фильтр на Агар пластины LB BG-11 без антибиотиков. Тщательно распределив 200 микролитров смеси E.coli/cyanobacterial culture на мембрану стерильным распространители или стерильным согнутым кончиком.
Печать пластины с парафиновой пленкой и поместите пластину в освещенный инкубатор в течение 24 часов. Через 24 часа тщательно перенесите мембрану с помощью стерилизованных огней типсов на свежую агарную пластину BG-11, содержащую соответствующие антибиотики для выбора грузового вектора. Печать пластины с парафиновой пленкой и инкубировать в тех же условиях, как ранее, пока колонии появляются.
Колонии обычно появляются через 7-14 дней для Synechocystis PCC 6803 и 3-7 дней для Synechococcus elongatus UTEX 2973. Чтобы выбрать спряженцев, используя тепловой стерильный инокулирующий стержень, выберите по крайней мере две отдельные колонии из мембраны и полосу на новую агарную пластину BG-11, содержащую соответствующие антибиотики. Затем привить полосу цианобактериальной культуры в 15 миллилитровую центрифугу, содержащую пять миллилитров среднего LB и инкубировать при 37 градусах по Цельсию на ночь при 225 об/мин в трясущемся инкубаторе.
Ясная культура подтверждает отсутствие заражения E.coli. После достаточного периода роста в семь дней, выбрать отдельные колонии топором для настройки жидких культур для долгосрочного хранения крио или последующих экспериментов. В этом исследовании был продемонстрирован рабочий процесс сборки золотых ворот.
После трансформации реакции сборки были выявлены успешные сборки с использованием стандартного синего белого скрининга колоний E.coli. Кассета выражения eYFP в векторе уровня 1 и конце связывают один вектор, затем были собраны в вектор вектора принятия уровня T, чтобы дать вектор cpcBA-eYFP. Собранный вектор cpcBA-eYFP был проверен с помощью пищеварения ограничений.
Успешная супружеская передача cpcBA-eYFP или вектора pPM-AK1-T привела к росту до нескольких сотен колоний на мембране для Synechocystis PCC 6803 и Synechococcus elongatus UTEX 2973. Как и ожидалось для сильного промоутера Pcpc560, значения для нормализованной флуоресценции eYFP от считывателя пластин и флуоресценции eYFP на клетку от цитометра потока были высокими по сравнению с отрицательным контролем. Как с считывателем пластин, так и с цитометром потока значения флуоресценции были выше в Synechococcus elongatus UTEX 2973, чем в Synechocystis PCC 6803.
Убедитесь, что вы инкубировать в течение минимального времени, в соответствии с которым штамм вы спряжения.
