새로 설계된 싱크로트론 x선 형광 나노 프로브는 시료의 원소 분포를 시각화할 수 있습니다. 극저온 접근법의 사용은 엑스레이 방사선 손상을 늦추기 위하여 필수적입니다. 따라서, 급속한 극저온은 세포 구조와 그 화학적 무결성의 보존을 최적화하기 위해 냉동 수화 세포를 얻기 위해 필수적이다.
싱크로트론 연구를 위한 세포 제제의 특이성은 동결 수화 세포 단층층을 획득하기 위한 이 프로토콜의 최적화로 이끌어 내게 합니다. 시각적 데모는 얇은 얼음 층 내에 내장 된 재현적으로 극저온 고정 된 세포를 달성하기 위해 세포 단층 샘플을 조작하는 방법을 이해하는 데 중요합니다. 실리콘 체탈화물 멤브레인 지지체를 준비하려면 멤브레인 지지체가 들어있는 캡슐을 열고 캡슐을 부드럽게 짜서 지지체를 가볍게 풀어냅니다.
얇은 핀셋을 사용하여 프레임 중앙에 있는 실리콘 질화물 멤브레인을 만지지 않도록 주의하고 프레임을 라미나르 플로우 캐비닛에 발견된 페트리 접시에 넣으세요. 그런 다음 UV는 멤브레인을 25~30분 동안 살균합니다. 멸균의 끝에서, 폴리 L-리신과 같은 부착 인자의 10 마이크로 리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 25분, 습도가 높은 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그런 다음 멸균 48웰 플레이트의 우물을 0.22 마이크로미터의 200~250마이크로리터로 채우고 우물당 초순수및 초미미미수로 여과하였다. 미세핀셋을 사용하여 멤브레인을 수직으로 조심스럽게 물에 10초 간 3개의 헹구는 데 사용하십시오.
헹구고, 멤브레인을 라미나르 플로우 후드 아래에 멸균 96웰 플레이트의 빈 우물에 수직으로 놓고 건조할 때까지 밤새 둡니다. 관심 있는 세포의 파종을 위해, 코팅된 멤브레인을 평평한 면을 멸균 4웰 플레이트의 한 웰에 올려 놓습니다. 적절한 배양 배지의 10 마이크로리터에서 4개의 세포에 5회 10번을 첨가하여 막을 건드리지 않고 실리콘 진타막의 표면에 넣습니다.
드롭은 전체 멤브레인을 커버해야합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 습도가 있는 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다. 세포가 기판에 부착하기 시작했을 때, 천천히 각 멤브레인을 덮고 각 우물의 벽 아래로 완전한 배양 배지의 1 밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 섭씨 37도, 습도가 있는 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다. 셀룰러 제제의 극저온동원을 위해 먼저 자동 플런지 냉동고를 켜고 섭씨 37도의 암모늄 아세테이트 버퍼로 12웰 플라스틱 플레이트에 적절한 수의 우물을 채웁니다. 멤브레인을 헹기 직전에 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 빠른 릴리스 핀셋 쌍의 검은 클램프 링을 사용하여 핀셋의 잠금을 해제합니다.
잠금 해제 된 핀셋을 사용하여 멤브레인 지지체를 파악하고 암모늄 아세테이트 버퍼 용액 내에서 멤브레인을 수직으로 약 5 초 동안 침수하십시오. 초과 버퍼를 제거하려면 멤브레인 지지체의 바닥을 필터 용지에 누르고 멤브레인이 종이에 닿지 않고 프레임의 각 면을 필터 용지에 블롯합니다. 초과 버퍼가 제거되면 환경 챔버 도어를 열고 핀셋을 집게 연동에 빠르게 밀어 넣고 챔버의 문을 닫습니다.
플로트 A 플런지를 누릅니다. 실리콘 질화물 멤브레인을 들고 있는 핀셋은 극저온으로 빠르게 급락합니다. 급락 동결 후, 미리 냉각 된 집게와 프레스 전송전송용기의 뚜껑을 제거합니다.
실리콘 질화물 멤브레인은 극저온 위로 약간 이동됩니다. 빠른 단일 움직임에서 핀셋을 집게 에서 약간 기울여 핀셋을 질소 액체로 채워진 전송 용기의 냉동 상자의 빈 슬롯에 직접 가져옵니다. 그런 다음 검은 색 클램프 링을 해제하여 멤브레인을 해제합니다.
플런지 냉동 셀의 동결 건조는 동결 건조 기기의 후면 패널에 있는 로커 스위치를 사용하여 기기에 전원을 공급합니다. 샘플을 로드할 준비가 되면 디스플레이에 누압 입력이 표시됩니다. 폴리스티렌 저장 용기에 공급 업체가 제공하는 샘플 전송 홀더 위에 실리콘 질소 막 황동 홀더를 장착하여 액체 질소의 수준을 첫 번째 황동 조각의 상단 가장자리보다 약 1 ~ 2 밀리미터 낮게 유지합니다.
상기 셀 샘플 측이 황동 홀더 번호가 매겨진 캐비티에 위를 향하여 멤브레인을 놓고 액체 질소가 채워진 폴리스티렌 폼 박스에서 이송 막대를 미리 냉각시킵니다. 막대를 사용하여 전체 조립품에 고정하고, 진공을 눌러 동결 건조기 챔버의 뚜껑을 열고, 즉시 동결 건조기 챔버에서 샘플을 전송하고, 동결 건조기 챔버 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 즉시 눌러 동결 건조 주기를 계속합니다.
동결 건조 주기의 끝에서, 챔버를 배출하고 동결 건조 샘플에 액세스하기 위해 전체 어셈블리를 제거하기 위해 정지를 누릅니다. 여기서 는 폴리-L-리신 코팅 실리콘 질화물 멤브레인 지지체에 서브배양된 냉동 수화 유방암 세포세포의 전형적인 광학 비디오 현미경이 입증된 바와 같이 나타난다. 얼어붙은 수화 세포의 X선 형광 원소 매핑은 칼륨, 황 및 아연과 같은 생리적 요소의 분포를 보여줍니다.
본 대표적인 예에서, 단단히 결합된 유황 원소는 칼륨을 관찰하는 것과 유사한 패턴으로 세포 내로 균등하게 분포되었고 세포 질량 프로파일의 양호한 추정을 나타낸다. 그러나 아연 분포는 사이토솔과 핵 사이의 신호가 명확하게 정의된 사이토솔보다 핵 내에서 더 높은 신호를 나타냈다. 이 전형적인 브라이트필드 현미경 검사에서 실리콘 질화물 막에서 직접 배양된 동결 건조 1차 마우스 해마 뉴런의 전형적인 시야에서, 세포는 그들의 배양 또는 보존 방법에 의해 영향을 받지 않는 전형적인 신경 형태를 나타낸다.
플런지-냉동 세포의 X선 형광 화상 진찰은 또한 50 100 나노미터 공간 해상도에서 이 대표적인 동결 건조 세포에 의해 전시된 전형적인 원소 분포를 제시합니다. 실리콘 질화물 창을 플롯하는 것은 급락 동결 후 세포의 가장 얇은 가능한 얼음 층을 얻기위한 것이 중요합니다. 세포 전지의 화학적 무결성을 보존하면 세포의 금속질이 싱크로트론 나노 프로브뿐만 아니라 다른 미세 분석 기술로 탐구될 수 있습니다.
모든 싱크로트론 나노 프로브 분석이 극저온 온도에서 수행될 수 있는 것은 아니기 때문에, 냉동 수화 세포는 실온에서 분석을 용이하게 하기 위해 더 동결 건조될 수 있다. 액체 질소로 작업 할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 항상 화염에서 멀리 연기 후드에 에탄 가스를 사용하는 것을 기억하십시오.
