ננו-גשושיות רנטגן סנכרון שעוצבו לאחרונה מאפשרות הדמיה של התפלגות היסודות של מדגם. השימוש בגישות קריוגניים הוא חובה כדי להאט את נזקי קרינת רנטגן. לכן, קריופיקציה מהירה חיונית להשגת תאים מיובשים קפואים כדי לייעל את שימור מבנה התא ושלמותו הכימית.
הספציפיות של ההכנות התאיות למחקרי סינכרוטרון מובילה לאופטימיזציה של פרוטוקול זה לרכישת מונואליירים תאים מיובשים קפואים. הדגמה חזותית חשובה להבנת האופן שבו ניתן לתפעל את דגימות המונוליאר של התאים כדי להשיג תאים קריופיקציה מתרבים המוטבעים בתוך שכבה דקה של קרח. כדי להכין תמיכה בממברנה ניטרד סיליקון, לפתוח את הקפסולה המכילה את התמיכה קרום בעדינות לסחוט את הקפסולה כדי לשחרר קלות את התמיכה.
השתמש פינצטה דקה כדי לתפוס פינה אחת של מסגרת הסיליקון דואג לא לגעת קרום סיליקון ניטריד במרכז המסגרת ול למקם את המסגרת לתוך צלחת פטרי חשופה ארון זרימה למינאר. לאחר מכן UV לעקר את הממברנה במשך 25 עד 30 דקות. בסוף הסטריליזציה, להוסיף 10 microliters של גורם מצורף כגון פולי-L-לינזין.
דגירה במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס וב 5% פחמן דו חמצני עם לחות. לאחר מכן מלאו בארות של צלחת סטרילית של 48 בארות עם 200 עד 250 מיקרוליטרים של 0.22 מיקרומטר מסוננים מים טהורים במיוחד ומעקב אולטרה ל באר. השתמש פינצטה עדין כדי להטביע בזהירות את הממברנה אנכית עם שלוש שטיפות רצופות של 10 שניות באר אחת של מים.
לאחר שטיפה, מניחים את הממברנה אנכית באר ריקה של צלחת סטרילית 96 באר מתחת מכסה המנוע לזרום למינאר ולהשאיר אותו לילה עד יבש. עבור זריעת התאים של עניין, מניחים את הממברנה מצופה עם הצד השטוח פונה למעלה באר אחת של צלחת סטרילית ארבע בארות. הוסף חמש פעמים 10 לארבעת התאים ב 10 microliters של מדיום תרבות מתאים לפני השטח של קרום סיליקון ניטריד מבלי לגעת קרום.
הירידה אמורה לכסות את כל הממברנה. ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות. כאשר התאים החלו להיצמד למצע, מוסיפים לאט מיליליטר של מדיום תרבות שלם במורד הקיר של כל באר המכסה כל קרום.
ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות. להקפאה של ההכנה התאית, הפעל תחילה מקפיא צלילה אוטומטי ומלא את המספר המתאים של בארות בצלחת פלסטיק 12 באר עם חיץ אצטט אמוניום 37 מעלות צלזיוס. מיד לפני שטיפה לצלול הקפאת הממברנה, להסיר את המדגם מהאינקובטור ולהשתמש בטבעת מהדק שחור של זוג פינצטה שחרור מהיר כדי לפתוח את פינצטה.
השתמש פינצטה נעולה לתפוס את התמיכה קרום לטבול את הממברנה אנכית בתוך פתרון מאגר אמוניום אצטט במשך כחמש שניות. כדי להסיר מאגר עודף כלשהו, לחץ על תחתית התמיכה בממברנה על נייר סינון ונפח כל צד של המסגרת על נייר הסינון מבלי לאפשר לממברנה לגעת בנייר. כאשר החיץ העודף הוסר, פתח את דלת התא הסביבתי, החלק במהירות את פינצטה לתוך המדפים משתלבים, וסגור את דלת התא.
לחץ כתם צלילה. פינצטה מחזיקה את קרום ניטרד סיליקון יהיה צלל במהירות לתוך קריוגן. לאחר הקפאת צלילה, להסיר את המכסה של מיכל ההעברה עם מדפים מקורר מראש ולהעביר לחץ.
קרום סיליקון ניטרד יועבר מעט מעל ההקפאה. בתנועה אחת מהירה, להחליק מעט להטות את הפינצטה מתוך המדפים משתלבים כדי להביא את פינצטה ישירות לתוך חריץ ריק של cryobox במיכל ההעברה מלא נוזל חנקן. ואז לשחרר את טבעת מהדק שחור כדי לשחרר את הממברנה.
לייבוש הקפאה של התאים הקפואים, השתמש במתג הנדנדה הממוקם בלוח האחורי של מכשיר הייבוש להקפאה כדי להפעיל את המכשיר. הצג יציג את הקשה על Enter כאשר תהיה מוכנה לטעון דוגמה. הר את מחזיק פליז ממברנה חנקן סיליקון על גבי מחזיק העברת מדגם המסופק על ידי הספק במיכל אחסון פוליסטירן שמירה על רמת חנקן נוזלי על אחד עד שני מילימטרים מתחת לקצה העליון של חתיכת פליז הראשון.
מניחים את הממברנה כשצד דגימת התא פונה כלפי מעלה בחלל ממוספר של מחזיק הפליז ומקררים מראש את מוט ההעברה בקופסת קצף פוליסטירן נוזלית מלאה בחנקן. השתמשו במוט כדי לנעול את ההרכבה המלאה, לחצו על הכניסה כדי לשבור את הוואקום כדי לשחרר את המכסה של תא מייבש ההקפאה, להעביר מיד את הדגימה בתא המייבש להקפאה ולסגור את מכסה תא המייבש. לאחר מכן מיד לחץ להתחיל להמשיך עם מחזור ייבוש ההקפאה.
בסוף מחזור הייבוש להקפאה, לחץ על עצור כדי לפרוק את התא ולהסיר את ההרכבה המלאה כדי לגשת לדגימות מיובשות בהקפאה. כאן תצוגת מיקרוסקופ וידאו אופטי טיפוסית של תאים קפואים של תאים סרטניים בשד מיובשים תת-תרבותיים על תמיכה קרום סיליקון ניטרד מצופה פולי L-ליזן כפי שהוכח. מיפוי יסודי של פלואורסצנטיות רנטגן של התאים הידראטיים הקפואים חושף את ההפצות של יסודות פיזיולוגיים כגון אשלגן, גופרית ואבץ.
בדוגמה מייצגת זו, אלמנט הגופרית ההדוק הופץ באופן שווה בתוך התא בתבנית דומה לזו שנצפתה עבור אשלגן ומייצג הערכה טובה של פרופיל המסה התאית. התפלגות האבץ, לעומת זאת, הפגינה אות גבוה יותר בתוך הגרעין מאשר בציטוזול עם הפרדה מוגדרת בבירור של האות בין הציטוסול לגרעין. בתצוגת מיקרוסקופיה טיפוסית זו של Brightfield microscopy של נוירונים ראשוניים מיובשים בהקפאה של עכברים בהיפוקמפוס המתורבים ישירות על קרום סיליקון ניטרייד כפי שהוכח, התאים מפגינים מורפולוגיה עצבית טיפוסית שאינה מושפעת מתרבותם או משיטת השימור שלהם.
הדמיית פלואורסצנטיות של קרני רנטגן של תאים קפואים צוללים חושפת גם הפצות יסודות טיפוסיות כפי שהוצגו על ידי תאים מיובשים בהקפאה ברזולוציה מרחבית של 50 עד 100 ננומטר. התוויית חלון ניטרד סיליקון היא קריטית להשגת שכבת הקרח הדקה ביותר האפשרית של תאים לאחר הקפאת צלילה. שמירה על השלמות הכימית של התאים ברמה התת-תאית מאפשרת לחקור את המתכת של התאים באמצעות ננו-גשושיות סינכרוטרון, כמו גם עם טכניקות מיקרואנליטיות אחרות.
כמו לא כל ניתוח סינכרוטרון ננו בדיקה יכול להתבצע בטמפרטורה קריוגנית, תאים מיובשים קפואים ניתן להקפיא עוד יותר מיובשים כדי להקל על הניתוח שלהם בטמפרטורת החדר. זכור להשתמש בציוד מגן אישי מתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי תמיד להשתמש בגז אתאן ברדס אדים הרחק להבות.
