流细胞测定方法测量造血干细胞和T细胞的线粒体质量及膜电位

该协议是一个简单的流细胞学为基础的测定，允许测量线粒体膜电位和线粒体质量在活细胞。标准代谢测定失败时，与罕见的人群，如造血干细胞。此方法使用户能够在使用低数量的细胞时进行线粒体膜分析，并确定新的细胞代谢调节器，如HSC。

此外，您可以将它与下游功能分析（如骨髓移植或菌落形成分析）相结合，以确定培养后细胞的功能。我们的技术可用于识别在骨髓移植和造血疗法后造血免疫恢复的背景下能够改善HSC功能的新分子。如我们的协议所述，我们的方法可用于评估免疫T细胞的代谢健康。

染色后，细胞对光线的暴露最小，这一点非常重要。此外，为了评估泵的回流的贡献，必须包括泵抑制剂维拉帕米尔的使用。然而，用户必须意识到，维拉帕米尔严重扰动离子平衡，不能用于评估代谢调节剂对线粒体膜电位的影响。

此方法的可视化演示非常重要，因为在使用数量很少的单元格时，需要记住一些关键步骤，并且用户在 PubMed 上阅读的常规文件中经常缺少这些步骤。对于 FAC 排序，识别由血统负、Sca1 阳性、cKit 阳性定义的 LKS 总体。在LKS群体中，大约5至10%的细胞的造血干细胞通过CD150阳性、CD48阴性组分的浇注来识别，这些细胞被贴上HSC的标签。

造血干细胞分选后，在摄氏4度下以300倍g离心管，5分钟。在不去除颗粒的情况下轻轻去除大部分上一提液，并在细胞颗粒上留下 50 到 80 微升。将干细胞扩张介质中的细胞颗粒重新用于最终体积为200微升。

准备一个无菌组织培养处理96 U底井板，并确定将培养细胞的井。转移以前在这些油井中准备的 100 微升 2 倍基底介质。在 NR 标记良好，添加两微升的 100 倍烟酰胺核糖二聚二聚剂溶液。

将 100 微升 2x 基底介质转移到孔中，用于染色控制。含有2倍基底介质的井顶部的已准备造血干细胞的种子100微升。种子100微升整个骨髓细胞在井标记为染色控制。

在周围所有油井中加入200微升的自 <3> <3>化水，以减少含有细胞的井中的蒸发。将板在37摄氏度的培养箱中不受干扰地放置，在5%的二氧化碳中放置72小时。每24小时拿出一块盘子补充一次烟酰胺核糖酰胺，然后放回孵化器。

在培养期结束时，在每个测试井中添加两个 100x TMRM 溶液的微升和两个 100 倍绿色荧光染色溶液的微升。在TMTM染色控制井中加入两个100倍TMTM微升。在 MitoTracker 染色控制井中加入两个 100 倍绿色荧光染色微升。

用铝箔盖住板的顶部。将盘子放回孵化器中，在37摄氏度的20%二氧化碳中放置45分钟。将板从培养箱中取出，以 300 倍 g 离心 5 分钟。

反转板以去除上流水，并添加 200 微升的标准 FACS 缓冲液重新暂停。用铝箔盖住盘子。以 300 次 g 离心板五分钟。

重复此洗涤步骤三次。将细胞重新填充在 200 微升的 FACS 缓冲液缓冲器中，并转移到 FACS 管中。要运行流式圆环仪上的样本，请先将单个颜色控件加载到机器中，并逐个记录每个事件中的至少 5，000 个事件。

在软件中，按"获取"，然后在仪表板上记录以获取和记录单个颜色控件。按"补偿设置"，然后单击"计算补偿"以计算补偿。一旦应用补偿，获取造血干细胞样本，并记录尽可能多的事件。

从 Cytometer 导出 FACS 文件，并在分析软件上打开该文件。在 FlowJo 上，使用向前散射和侧散射门来标识细胞总体。识别下一个关卡中的单数，然后绘制表示活细胞的 DAPI 负分数。

在活细胞门中，在TMM和绿色荧光染色通道中绘制一个轮廓图，分别测量线粒体膜电位和质量。在活细胞门中导出这两个通道的均荧光强度。然后，在所有样品中导出 TMRM 低门中的细胞比例。

烟酰胺核糖酰胺治疗表明，TMRM低人口明显增加。它还显著增加了TMM低门中细胞的比例，并显示出TMTM荧光强度的显著降低。线粒体质量在烟酰胺核糖酰胺补充剂后没有改变。

此外，干细胞标记染色与线粒体染色后培养相结合。通过识别造血干细胞的浇注策略，接触烟酰胺核糖酰胺表明TMM低人群显著增加，并显著降低了封闭HSC的TMM荧光强度。绿色荧光线粒体染色绿色信号在两个条件下保持不变。

重要的是要用铝箔覆盖染色板，以尽量减少光线暴露在染色样品中。此方法可以与下游检测（如骨髓移植和菌落形成测定）相结合，以确定您的干细胞的功能。因此，该技术允许一个简单的筛选方法，用于识别HSC的新的代谢调节器。