通过斯特兰德特异性RT-PCR检测患者人类免疫缺陷病毒类型1（HIV-1）反义蛋白（ASP）RNA转录本

传统的RT-PCR不允许在检测由重叠基因编码的RNA时对感觉序列和反感觉序列进行区分。该协议使得可以检测特别反感觉RNA。使用生物仿制品底剂和高RNA变性温度，可以扩增抗感cDNA，防止非特异性RT产品的形成。

我们用这种方法来证明，ASP无论是作为RNA抗感觉还是作为蛋白质前体，它都成为一种新的HIV抗原，它有可能成为新的HIV治疗靶点。此方法可应用于任何系统，其中可检测重叠基因中的抗感觉RNA。首先使用 PanASP 底转本内部的亲病毒 DNA 序列设计患者特定的底转。

接下来，使用DNase处理样品，量化RNA并消除DNA污染。将 0.1 微克总 RNA 转移到 96 孔 PCR 板上的适当孔中。然后根据手稿指示设置反向转录或 RT 反应。

通过添加五微升无核酸酶无水代替 ASP 反向底原，准备内源性 RT 控制。将板放入热循环器中，将RNA加热至94摄氏度5分钟。然后立即在冰水中冷却至少一分钟。

如文本手稿所述，在 1.5 毫升管中准备反应混合物，然后将 17.5 微升转移到每个含有孔的 RNA 中。RNA变性必须在94摄氏度下进行。如果没有完全变性，可能会发生来自感觉RNA的非特异性产品的合成，导致非特异性cDNA的扩增。

轻轻混合井内装物，在55摄氏度下孵育板60分钟。然后，将板加热至70摄氏度15分钟，使反应灭活。根据手稿说明准备一升 2X 洗涤和装订缓冲液，并过滤溶液。

接下来，使用PCR级水准备50毫升1X洗涤和装订缓冲液。将适当数量的链球蛋白结合磁珠转移到1.5毫升管中，然后通过添加2X洗涤和结合缓冲液的等量进行洗涤，并旋转管15秒。将管子放入磁性分离机架中，并在室温下孵育三分钟。

然后，小心地取出上流液，而不干扰珠子，并添加与珠子初始体积相同的2X洗涤和装订缓冲液的体积。旋转珠子30秒，将悬浮液的10微升转移到适当数量的1.5毫升管。将管子放在磁性分离架中，并在室温下孵育三分钟。

然后，丢弃上流液，并添加50微升的2X洗涤和装订缓冲液。将50微升生物仿生cDNA加入相应的管子中，用珠子孵育30分钟，轻轻旋转。孵育后，将管子放在磁性分离架上三分钟，然后用200微升1X洗涤和装订缓冲液清洗珠子，然后在分离架上孵育三分钟。

丢弃上一杯，重复洗涤两次。然后，将珠子重新在PCR级水的10微升中重新浇水。根据手稿说明准备适当的 PCR 主混合卷。

混合好，并迅速旋转下来，然后转移49微升每井到96井PCR板。用纯化的cDNA小心地旋转管15秒，并将悬浮液的微升添加到相应的孔中。运行 PCR 并在 1%的加糖凝胶上分离产品。

从凝胶中切割带，将放大的产品克隆成PCR 2.1质粒。然后对克隆进行测序并分析每个序列。初始RT反应使用常规非生物化抗感觉底原，成功扩增了SATP。

然而，相同分子量和底数减去对联的波段也被放大。为了绕过这个问题，特定的抗感觉底像被标记为生物tyn，由此产生的抗感觉cDNA在PCR之前被净化。这使得扩大 ASP 序列成为可能，从而大大减少了底流减控制中非特异性 cDNA 的污染。

该方法在RT前在94摄氏度下完全变性，随后在冰水中立即冷却，从而有效放大了SAMP波段，没有非特异性产品，从而实现了该方法的进一步优化。测量了 ASP RNA 的动力学，从三个HIV阳性受试者中分离出CD4细胞，这些受试者具有可检测的病毒血症，并且在用抗CD3/CD28刺激后没有治疗。在接受治疗治疗的患者中，ASP RNA的定量也是可能的，具有检测性极小。

在三分之二的患者中，ASP RNA 在刺激后三到五天的低水平被检测出来。对两名患者进行了 ASP 和 env RNA 分析，一名未经治疗，一名治疗。对于未经治疗的患者，可以检测到两个RNA。

对于治疗的患者，ASP 和 env 在经过几天的刺激后几乎无法检测到。在尝试此程序时，重要的是要记住变性使RNA线性化，以便能够以RT为底的二级结构被破坏。然而，洗涤珠子会冲走非生物化的cDNA。

在用正确的极性纯化cDNA后，可以执行qPCR来分析基因表达。此外，也可以克隆cDNA并用于序列分析。这种方法允许研究基因重叠在相反的方向，并可能可用于阐明细菌和病毒相关疾病，包括某些类型的癌症的调控和发病机制。