기존의 RT-PCR은 겹치는 유전자에 의해 인코딩된 RNA를 검출하는 데 사용될 때 감각과 반감각 서열 사이의 차별을 허용하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하면 특히 안티 센스 RNA를 감지 할 수 있습니다. 높은 RNA 데니션 온도와 함께 생체 화 프라이머를 사용하면 안티 센스 cDN의 증폭을 허용하여 비특이적 RT 제품의 형성을 방지합니다.
우리는 ASP가 RNA 항감각 또는 단백질 전구체로서, 새로운 HIV 항원, 잠재적으로 치료를 위한 새로운 HIV 표적을 한다는 것을 보여주기 위하여 이 방법을 이용했습니다. 이 방법은 겹치는 유전자에서 반감각 RNA가 검출될 수 있는 어떤 시스템에도 적용될 수 있습니다. PanASP 프라이머 내부의 프로 바이러스 DNA 서열을 사용하여 환자 특정 프라이머를 설계하여 시작합니다.
다음으로, RNA를 정량화하고 DNase로 견본을 취급하여 DNA 오염을 제거합니다. 총 RNA의 0.1 과 1 마이크로그램 사이를 96 개의 잘 PCR 플레이트에 적합한 우물로 옮기. 그런 다음 원고 방향에 따라 역 전사 또는 RT 반응을 설정합니다.
ASP 역 프라이머 대신 뉴클레아제 프리 워터 5마이크로리터를 추가하여 내인성 RT 컨트롤을 준비한다. 플레이트를 열순환기로 넣고 RNA를 섭씨 94도로 5분간 가열합니다. 그런 다음 즉시 적어도 1 분 동안 차가운 물에 식힙니다.
텍스트 원고에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 튜브에서 반응 혼합물을 준비한 다음, 17.5 마이크로리터를 각 RNA에 우물을 함유한다. RNA 데니션은 섭씨 94도에서 수행해야 합니다. 총 내성 없이, 감각 RNA로부터 비특이적 제품의 합성이 발생할 수 있으며, 이는 비특이적 cDNA의 증폭으로 이어질 수 있다.
우물의 내용물들을 부드럽게 섞고 접시를 섭씨 55도에서 60분간 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 70도까지 15분 동안 가열하여 반응을 비활성화합니다. 원고 방향에 따라 2X 세척 및 바인딩 버퍼 1리터를 준비하고 용액을 필터링합니다.
다음으로 PCR 급수를 사용하여 1X 세척 및 바인딩 버퍼 50 밀리리터를 준비합니다. 적절한 수의 스트렙타비딘-유도 마그네틱 구슬을 1.5밀리리터 튜브로 옮은 다음, 2배의 세척 및 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 15초 동안 튜브를 소용돌이시켜 세척합니다. 튜브를 자기 분리 랙에 넣고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
그런 다음, 구슬을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하고 구슬의 초기 부피와 2X 세척 및 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. 구슬을 30초 동안 소용돌이게 하고 서스펜션의 10마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 적절히 옮겨냅니다. 튜브를 자기 분리 랙에 놓고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 상체를 버리고 2X 세척 및 바인딩 버퍼의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 50 마이크로리터의 생체분해된 cDNA를 구슬로 해당 튜브에 추가하고 부드럽게 회전하면서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 3분 동안 자기 분리 랙에 튜브를 놓고 1X 세척 및 바인딩 버퍼의 200 마이크로리터로 구슬을 세척한 다음 분리 랙에 3분 배양을 합니다.
상체를 버리고 두 번 씻는 것을 반복하십시오. 그런 다음, PCR 급수의 10 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다. 원고 방향에 따라 적절한 양의 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
잘 섞어서 빠르게 회전한 다음 잘 하면 49마이크로리터를 96개의 PCR 플레이트로 옮기습니다. 15초 동안 정제된 cDNA로 튜브를 조심스럽게 소용돌이치게 하고 해당 우물에 서스펜션의 마이크로리터 1개를 추가합니다. PCR을 실행하고 1 % 아가로즈 젤에 제품을 분리합니다.
젤에서 밴드를 잘라 PCR 2.1 플라스미드로 증폭 된 제품을 복제합니다. 그런 다음 클론을 시퀀스하고 각 시퀀스를 분석합니다. 초기 RT 반응은 일반 비생물학적 안티센스 프라이머로 수행되었고 ASP의 성공적인 증폭을 초래했다.
그러나, 동일한 분자량및 프라이머 마이너스 대조군의 밴드도 증폭되었다. 이러한 문제점을 우회하기 위해, 특정 반센스 프라이머는 비오틴으로 표지되었고, 그 결과 반감각 cDNA는 PCR 이전에 정제되었다. 이를 통해 프라이머 마이너스 컨트롤에서 비특이적 cDNA로부터의 오염이 크게 감소하여 ASP 서열을 증폭시킬 수 있었습니다.
이 방법의 추가 최적화는 RT 이전에 섭씨 94도에서 RNA의 완전한 내포화에 의해 달성되었고, 얼음 물에 즉각적인 냉각을 거쳐 ASP 대역의 효과적인 증폭과 비특이적 제품이 발생하지 않았다. ASP RNA의 운동학은 검출 가능한 viremia및 항 CD3/CD28로 자극다음 치료의 부재를 가진 3개의 HIV 양성 과목에서 분리된 CD4 세포를 측정하고 CD4 세포. ASP RNA의 정량화는 또한 비 검출 가능한 viremia를 가진 ART를 겪고 있는 환자에서 가능했습니다.
3명의 환자 중 2개에서 ASP RNA는 3~5일 후에 낮은 수준에서 자극을 받았다. 2명의 환자는 ASP와 env RNA를 위해 분석되었습니다, 1개는 치료되지 않고 1개 취급되었습니다. 치료되지 않은 환자를 위해, 둘 다 RNA를 검출할 수 있었습니다.
치료된 환자를 위해, ASP및 env는 자극의 며칠 후에 거의 검출될 수 있었습니다. 이 절차를 시도할 때, 탈고가 RNA를 선형화하여 RT를 프라임할 수 있는 이차 구조물이 파괴된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 반면, 구슬의 세척은 비 생물학적 cDN을 씻어낸다.
정확한 극성으로 cDNA를 정제한 후, qPCR은 유전자 발현을 분석하기 위해 수행될 수 있다. 또한 cDNA는 시퀀스 분석에도 복제되고 사용될 수 있습니다. 이 방법은 반대 방향으로 겹치는 유전자를 연구할 수 있게 해주며, 일부 유형의 암을 포함한 박테리아및 바이러스 관련 질병의 조절 및 병발생을 해명하는 데 유용할 수 있다.
