Les RT-PCR conventionnels ne permettent pas la discrimination entre les séquences de sens et d’anti-sens lorsqu’ils sont utilisés pour détecter les ARN codés par des gènes qui se chevauchent. Ce protocole permet de détecter spécifiquement les ARN anti-sens. L’utilisation d’amorces biotynylated avec des températures élevées de dénaturation d’ARN permet l’amplification des cDNA anti-sens, empêchant la formation des produits non spécifiques de RT.
Nous avons utilisé cette méthode pour démontrer que l’ASP, soit comme anti-sens arn, soit comme précurseur de protéines, c’est un nouvel antigène anti-VIH, est-ce potentiellement une nouvelle cible pour le VIH pour le traitement. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système, dans lequel des ARN anti-sens provenant de gènes qui se chevauchent peuvent être détectés. Commencez par concevoir des amorces spécifiques aux patients à l’aide de la séquence d’ADN pro-virale interne aux amorces PanASP.
Ensuite, quantifier l’ARN et éliminer la contamination par l’ADN en traitant les échantillons avec du DNase. Transférer entre 0,1 et un microgramme d’ARN total dans les puits appropriés sur une plaque PCR de 96 puits. Ensuite, configurer la transcription inverse, ou réaction RT, selon les instructions manuscrites.
Préparez les commandes endogènes de RT en ajoutant cinq microlitres d’eau libre de nucléase au lieu de l’amorce inverse d’ASP. Mettez la plaque dans le thermocycleur et chauffer l’ARN à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, refroidissez-le immédiatement dans de l’eau glacée pendant au moins une minute.
Préparer le mélange de réaction dans un tube de 1,5 millilitre tel que décrit dans le manuscrit du texte, puis transférer 17,5 microlitres à chacun des puits contenant de l’ARN. La dénaturation de l’ARN doit être effectuée à 94 degrés Centigrades. Sans dénaturation totale, des synthèses de produits non spécifiques à partir d’ARN de sens peuvent se produire, conduisant à l’amplification des ADNN non spécifiques.
Mélanger délicatement le contenu des puits et incuber la plaque à 55 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, inactivez les réactions en chauffant la plaque à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Préparez un litre de tampon de lavage et de liaison 2X selon les instructions manuscrites et filtrez la solution.
Ensuite, préparez 50 millilitres de tampon de lavage et de liaison 1X à l’aide d’eau de qualité PCR. Transférez le nombre approprié de perles magnétiques conjuguées à la streptavidine dans un tube de 1,5 millilitre, puis lavez-les en ajoutant un volume égal de tampon de lavage et de liaison 2X et en vortexant le tube pendant 15 secondes. Placez le tube dans un support de séparation magnétique et incubez-le pendant trois minutes à température ambiante.
Ensuite, retirez soigneusement le supernatant sans déranger les perles et ajoutez le même volume du tampon de lavage et de fixation 2X que le volume initial des perles. Vortex les perles pendant 30 secondes et transférer 10 microlitres de la suspension à un nombre approprié de tubes de 1,5 millilitre. Placez les tubes dans le support de séparation magnétique et incubez-les pendant trois minutes à température ambiante.
Ensuite, jetez le supernatant et ajoutez 50 microlitres de tampon de lavage et de liaison 2X. Ajouter 50 microlitres de cDNA biotynylé aux tubes correspondants avec les perles et les incuber pendant 30 minutes tout en tournant doucement. Après l’incubation, placer les tubes sur la grille de séparation magnétique pendant trois minutes, puis laver les perles avec 200 microlitres de tampon de lavage et de liaison 1X, suivi d’une incubation de trois minutes sur la grille de séparation.
Jeter le surnatant et répéter le lavage deux fois. Ensuite, resuspendez les perles dans 10 microlitres d’eau de qualité PCR. Préparez un volume approprié de PCR Master Mix selon les instructions manuscrites.
Bien mélanger et le faire tourner rapidement vers le bas, puis transférer 49 microlitres par puits à une plaque PCR 96 bien. Vortex soigneusement les tubes avec le cDNA purifié pendant 15 secondes et ajouter un microlitre de la suspension aux puits correspondants. Exécutez le PCR et séparez les produits sur un gel agarose de 1%.
Couper les bandes du gel et cloner les produits amplifiés dans un plasmide PCR 2.1. Séquencez ensuite les clones et analysez chaque séquence. Les réactions initiales de RT ont été exécutées avec l’amorce anti-sens non biotynylated régulière et ont eu comme conséquence l’amplification réussie d’ASP.
Cependant, une bande du même poids moléculaire et des contrôles d’amorce moins a également été amplifiée. Pour contourner ce problème, l’amorce anti-sens spécifique a été étiquetée avec du biotyn et l’ADN anti-sens qui en a résulté a été purifiée avant pcr. Cela a permis d’amplifier la séquence ASP avec une contamination considérablement réduite de l’ADNC non spécifique dans l’amorce moins les contrôles.
D’autres optimisations de cette méthode ont été réalisées par dénaturation complète de l’ARN à 94 degrés Celsius avant rt, suivie d’un refroidissement immédiat sur l’eau glacée, ce qui a entraîné une amplification efficace de la bande ASP et aucun produit non spécifique. La cinétique de l’ARN ASP a été mesurée et les cellules CD4 isolées de trois sujets séropositifs atteints de viremia détectable et d’une absence de thérapie après stimulation avec anti-CD3/CD28. La quantification de l’ARN d’ASP était également possible dans les patients subissant la multithérapie, avec viremia non détectable.
Dans deux patients sur trois, l’ARN d’ASP a été détecté dans les niveaux bas à trois à cinq jours après stimulation. Deux patients ont été analysés pour ASP et ENV ARN, un non traité et un traité. Pour le patient non traité, les deux ARN pourraient être détectés.
Pour le patient traité, ASP et env étaient à peine détectables après plusieurs jours de stimulation. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que la dénaturation linéarise l’ARN de sorte que les structures secondaires capables d’amorce RT sont détruites. Attendu que le lavage des perles chasse les CDA non biotynylés.
Après purification des CDA avec la polarité correcte, qPCR peut être effectué pour analyser l’expression des gènes. En outre, les ADN peuvent également être clonés et utilisés pour l’analyse des séquences. Cette méthode permet d’étudier les gènes qui se chevauchent dans une orientation opposée et peut être utile pour élucider la régulation et la pathogénie d’une bactérie et d’une maladie liée au virus, y compris certains types de cancer.
