Обычные РТ-ПЦР не допускают дискриминации между смыслом и анти-чувственных последовательностей при использовании для обнаружения РНК, кодируемых перекрывающимися генами. Этот протокол позволяет обнаруживать конкретно анти-смысл РНК. Использование биотинилированных грунтовок наряду с высокой температурой денатурации РНК позволяет усиление анти-чувственных цДНК, предотвращая образование неспецифических продуктов RT.
Мы использовали этот метод, чтобы продемонстрировать, что ASP либо как РНК анти-чувство или белка предшественника, это новый антиген ВИЧ, делает это потенциально новый целевой ВИЧ для терапии. Этот метод может быть применен к любой системе, в которой анти-чувство РНК от перекрывающихся генов могут быть обнаружены. Начните с проектирования пациента конкретных грунтовки с использованием провирусной последовательности ДНК внутренних PanASP грунтовки.
Далее, количественно РНК и устранить загрязнение ДНК путем лечения образцов с DNase. Передача от 0,1 до одного микрограмма общей РНК в соответствующие скважины на 96 скважин ПЦР пластины. Затем установите обратную транскрипцию, или реакцию RT, в соответствии с рукописными указаниями.
Подготовьте эндогенные элементы управления RT, добавив пять микролитров нуклеазной свободной воды вместо реверсной грунтовки ASP. Положите пластину в термоциклер и нагреть РНК до 94 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем немедленно охладить его в ледяной воде, по крайней мере одну минуту.
Подготовь реакционной смеси в 1,5 миллилитровую трубку, как описано в текстовой рукописи, а затем передать 17,5 микролитров для каждой из РНК, содержащей скважины. ДЕНАтурация РНК должна проводиться при 94 градусах по Цельсию. Без тотальной денатурации могут возникать синтезы неспецифических продуктов из смысловой РНК, что приводит к усилению неспецифических цДНА.
Смешайте содержимое колодцев осторожно и инкубировать пластину при 55 градусах по Цельсию в течение 60 минут. Затем инактивировать реакции, нагревая пластину до 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Подготовь один литр 2X стирального и связывающего буфера в соответствии с рукописными указаниями и отфильтруй решение.
Затем подготовьте 50 миллилитров 1X стирального и связывающего буфера с использованием воды класса PCR. Перенесите соответствующее количество стрептавидин-конъюгированных магнитных бусин в 1,5 миллилитровую трубку, затем помойте их, добавив равный объем 2X стирального и связывающего буфера и вихревого трубки в течение 15 секунд. Поместите трубку в магнитную стойку разделения и инкубировать его в течение трех минут при комнатной температуре.
Затем аккуратно удалите супернатант, не нарушая бисера и добавьте тот же объем 2X стирального и связывающего буфера, что и первоначальный объем бисера. Вихрь бисера в течение 30 секунд и передачи 10 микролитров подвески в соответствующее количество 1,5 миллилитров труб. Поместите трубки в магнитную стойку разделения и инкубировать их в течение трех минут при комнатной температуре.
Затем отбросьте супернатант и добавьте 50 микролитров 2X стирального и связывающего буфера. Добавьте 50 микролитров биотинилированного кДНА в соответствующие трубки с бисером и инкубировать их в течение 30 минут, мягко вращаясь. После инкубации поместите трубки на магнитную стойку разделения в течение трех минут, затем помойте бисер 200 микролитров 1X стирального и связывающего буфера, а затем трехминутную инкубацию на стойке разделения.
Откажитесь от супернатанта и повторите стирку дважды. Затем, повторного незаменимия бисера в 10 микролитров воды класса ПЦР. Подготовь соответствующий том PCR Master Mix в соответствии с рукописными указаниями.
Смешайте его хорошо и быстро спина его вниз, а затем передать 49 микролитров на колодец в 96 хорошо ПЦР пластины. Тщательно вихревые трубки с очищенным cDNA в течение 15 секунд и добавить один микролитер подвески к соответствующим скважинам. Запустите ПЦР и разделите продукты на 1%agarose гель.
Вырежьте полосы из геля и клонировать усиленные продукты в ПЦР 2.1 плазмида. Затем секвенируйте клонов и проанализируйте каждую последовательность. Первоначальные реакции RT были выполнены с регулярной не биотинилированной анти-смысл грунтовка и привело к успешному усилению ASP.
Тем не менее, полоса того же молекулярного веса и грунтовки минус элементы управления также была усилена. Чтобы обойти эту проблему, специфическая анти-чувство грунтовка была помечена биотина и в результате анти-чувство cDNA был очищен до ПЦР. Это позволило усилить последовательность ASP с значительно уменьшенным загрязнением от неспецифического cDNA в грунтовки минус управления.
Дальнейшая оптимизация этого метода была достигнута путем полной денатурации РНК при 94 градусах Цельсия до RT, а затем немедленного охлаждения ледяной воды, что привело к эффективному усилению полосы ASP и отсутствие неспецифических продуктов. Кинетики ASP РНК были измерены и CD4 клетки изолированы от трех ВИЧ-позитивных субъектов с обнаруживаемой вирусемии и отсутствие терапии после стимуляции с анти-CD3/CD28. Количественная оценка РНК ASP также возможна у пациентов, проходящих АРТ, с необнамечиваемой вирусемией.
У двух из трех пациентов, ASP РНК была обнаружена в низких уровнях в три-пять дней после стимуляции. Два пациента были проанализированы на ASP и env РНК, один необработанных и один лечение. Для необработанного пациента, оба РНК могут быть обнаружены.
Для лечения пациента, ASP и env были едва заметны после нескольких дней стимуляции. При попытке этой процедуры, важно помнить, что денатурация linearizes РНК так, что вторичные структуры, способные премьер RT разрушаются. В то время как мытье бисера смывает не биотинилированные цДНА.
После очищения цДНК с правильной полярностью, qPCR может быть выполнен для анализа экспрессии генов. Кроме того, cDNAs также могут быть клонированы и использованы для анализа последовательности. Этот метод позволяет изучать гены, перекрывающиеся в противоположной ориентации, и может быть полезен в выяснении регуляции и патогенеза бактерий и связанных с вирусом заболеваний, включая некоторые виды рака.
