Gli RT-PCR convenzionali non consentono discriminazioni tra le sequenze di senso e anti-senso quando vengono utilizzati per rilevare gli RNA codificati da geni sovrapposti. Questo protocollo consente di rilevare RNA specificamente anti-senso. L'uso di primer biotinolati insieme ad alte temperature di denaturazione dell'RNA consente l'amplificazione di cDNA anti-senso, impedendo la formazione di prodotti RT non specifici.
Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che l'ASP sia come anti-senso dell'RNA che come precursore proteico, è un nuovo antigene hiv, lo fa potenzialmente un nuovo bersaglio hiv per la terapia. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema, in cui possono essere rilevati RNA anti-senso da geni sovrapposti. Inizia progettando primer specifici per pazienti utilizzando la sequenza di DNA pro-virale interna ai primer PanASP.
Successivamente, quantificare l'RNA ed eliminare la contaminazione da DNA trattando campioni con DNasi. Trasferire tra 0,1 e un microgrammo di RNA totale nei pozzi appropriati su una piastra PCR da 96 porri. Quindi impostare la trascrizione inversa, o reazione RT, secondo le indicazioni del manoscritto.
Preparare i controlli RT endogeni aggiungendo cinque microlitri di acqua libera da nucleasi anziché il primer inverso ASP. Mettere la piastra nel termociclo e riscaldare l'RNA a 94 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raffreddarlo immediatamente in acqua ghiacciata per almeno un minuto.
Preparare la miscela di reazione in un tubo da 1,5 millilitri come descritto nel manoscritto testuale, quindi trasferire 17,5 microlitri in ciascuno degli RNA contenenti pozzi. La denaturazione dell'RNA deve essere eseguita a 94 gradi centigradi. Senza denaturazione totale, possono verificarsi sintesi di prodotti non specifici dall'RNA di senso, portando all'amplificazione di cDNA non specifici.
Mescolare delicatamente il contenuto dei pozzi e incubare la piastra a 55 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi, inattivare le reazioni riscaldando la piastra a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Preparare un litro di tampone di lavaggio e rilegatura 2X in base alle indicazioni manoscritte e filtrare la soluzione.
Successivamente, preparare 50 millilitri di tampone di lavaggio e rilegatura 1X utilizzando acqua di grado PCR. Trasferire il numero appropriato di perline magnetiche coniugate con streptavidina in un tubo da 1,5 millilitri, quindi lavarle aggiungendo un volume uguale di tampone di lavaggio e legame 2X e vortice del tubo per 15 secondi. Posizionare il tubo in un rack di separazione magnetico e incubarlo per tre minuti a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere con cura il supernatante senza disturbare le perline e aggiungere lo stesso volume del tampone di lavaggio e rilegatura 2X del volume iniziale delle perline. Vortice le perline per 30 secondi e trasferire 10 microlitri della sospensione ad un numero appropriato di tubi da 1,5 millilitri. Posizionare i tubi nel rack di separazione magnetica e incubarli per tre minuti a temperatura ambiente.
Quindi, scartare il supernatante e aggiungere 50 microlitri di lavaggio 2X e tampone di legame. Aggiungere 50 microlitri di cDNA biotinilato ai tubi corrispondenti con le perline e incubarli per 30 minuti ruotando delicatamente. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi sul rack di separazione magnetica per tre minuti, quindi lavare le perline con 200 microlitri di lavaggio 1X e tampone di legame, seguito da un'incubazione di tre minuti sul rack di separazione.
Scartare il supernatante e ripetere il lavaggio due volte. Quindi, rimospendare le perline in 10 microlitri di acqua di grado PCR. Preparare un volume appropriato di PCR Master Mix in base alle indicazioni manoscritte.
Mescolarlo bene e farlo girare rapidamente verso il basso, quindi trasferire 49 microlitri per pozzo su una piastra PCR da 96 po '. Vortice attento i tubi con il cDNA purificato per 15 secondi e aggiungere un microlitro della sospensione ai pozzi corrispondenti. Eseguire la PCR e separare i prodotti su un gel di agarosio dell'1%.
Tagliare le bande dal gel e clonare i prodotti amplificati in un plasmide PCR 2.1. Quindi sequenziare i cloni e analizzare ogni sequenza. Le prime reazioni RT sono state eseguite con il regolare primer anti-senso non biotinylato e hanno portato ad un'amplificazione riuscita dell'ASP.
Tuttavia, fu amplificata anche una banda dello stesso peso molecolare e controlli più minuscoli. Per aggirare questo problema, il primer anti-senso specifico è stato etichettato con biotin e il cDNA anti-senso risultante è stato purificato prima della PCR. Ciò ha permesso di amplificare la sequenza ASP con una contaminazione notevolmente ridotta dal cDNA non specifico nei controlli primer minus.
Un'ulteriore ottimizzazione di questo metodo è stata ottenuta con la completa denaturazione dell'RNA a 94 gradi Celsius prima di RT, seguita dal raffreddamento immediato sull'acqua ghiacciata, che ha portato a un'amplificazione efficace della banda ASP e nessun prodotto non specifico. La cinetica dell'RNA ASP è stata misurata e le cellule CD4 isolate da tre soggetti sieropositiva con viremia rilevabile e assenza di terapia a seguito di stimolazione con anti-CD3/CD28. La quantificazione dell'RNA ASP è stata possibile anche in pazienti sottoposti ad ART, con viremia non rilevabile.
In due pazienti su tre, l'RNA ASP è stato rilevato in bassi livelli a tre o cinque giorni dopo la stimolazione. Due pazienti sono stati analizzati per ASP e env RNA, uno non trattato e uno trattato. Per il paziente non trattato, entrambi gli RNA potrebbero essere rilevati.
Per il paziente trattato, ASP e env erano a malapena rilevabili dopo diversi giorni di stimolazione. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la denaturazione linearizza l'RNA in modo che le strutture secondarie in grado di innescare RT siano distrutte. Mentre, il lavaggio delle perline lava via i cDNA non biotinilati.
Dopo la purificazione dei cDNA con la polarità corretta, qPCR può essere eseguito per analizzare l'espressione genica. Inoltre, i cDNA possono anche essere clonati e utilizzati per l'analisi delle sequenze. Questo metodo consente di studiare i geni che si sovrappongono con orientamento opposto e può essere utile per chiarire la regolazione e la patogenesi di un batterio e di una malattia correlata al virus, compresi alcuni tipi di cancro.
