该协议允许通过E3连接酶评估特定底物的泛素化。我们知道，连接酶 - 底物相互作用的表征对于理解它们在细胞中的功能至关重要。这种技术不需要昂贵的试剂或复杂的设备。
它需要质粒和编码感兴趣的基因，开发一种使用细胞裂解物的免疫沉淀测定，以及蛋白质印迹来检测底物泛素化。癌症和神经系统疾病等几种人类疾病与E3连接酶失调有关。因此，通过特定的E3连接酶鉴定底物泛素化可以帮助治疗或诊断这些疾病。
演示程序将由瓦伦丁·斯帕尼奥尔完成。首先，在Dulbecco的改性Eagles培养基中将HEK293T细胞系生长至80%至90%汇合，其中补充有10%胎牛血清和100单位青霉素，100微克链霉素和每毫升0.292毫克L-谷氨酰胺。然后，将此培养物在37摄氏度下孵育在加湿的细胞培养箱中，以5%的二氧化碳。
通过使用血清学移液管从培养皿中吸出培养基来传代细胞，并用一毫升灭菌的1X PBS洗涤一次。接下来，通过加入一毫升胰蛋白酶乙二胺四乙酸溶液分离细胞，并在37摄氏度下孵育五分钟后，使用血清学移液管将这些细胞重悬于两毫升生长培养基中。将细胞悬浮液转移到新鲜干净的15毫升管中，并在室温下以500倍G离心5分钟。
然后，轻轻地除去上清液，并通过上下移液将细胞沉淀重悬于三毫升生长培养基中，以获得均匀的细胞悬浮液。然后，将一毫升该细胞悬浮液转移到含有9毫升生长培养基的100毫米TC处理的培养皿中。在转染之前，请验证细胞是否不受污染，以及是否有足够的汇合度进行瞬时转染。
对于每个转染样品，通过在100微升Opti-MEM 1还原血清培养基中稀释每个质粒的3微克来制备DNA-聚乙烯亚胺复合物，而无需补充，并通过上下移液将其轻轻混合。接下来，在室温下解冻DNA-聚乙烯亚胺，然后按照每一微克DNA中三微升的DNA-聚乙烯亚胺的比例将其添加到溶液中。通过上下移液使溶液均质化。
然后，在室温下孵育15分钟以允许形成DNA-聚乙烯亚胺复合物。将总体积的DNA-聚乙烯亚胺复合物加入到含有细胞培养物的每个培养皿中，并通过来回摇动板来轻轻混合。然后，将这些细胞在37摄氏度下孵育在加湿的细胞培养箱中。
孵育后和细胞裂解前6小时，用10微摩尔蛋白酶体抑制剂MG132处理转染的细胞，并将细胞孵育在加湿的细胞培养箱中。接下来，使用血清学移液管从每个培养皿中吸出培养基，并用一毫升1X PBS洗涤细胞一次。然后，通过加入一毫升胰蛋白酶分离细胞，并将培养皿在37摄氏度下孵育五分钟。
将细胞重悬于一毫升生长培养基中，并将细胞悬浮液转移到新鲜干净的两毫升微管中，并在室温下以500倍G离心五分钟。离心结束后，小心地倒出上清液，轻轻地将细胞沉淀重悬于200微升冰冷的MP40裂解缓冲液中，并补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。然后将该溶液转移到干净的1.5毫升微管中。
将此细胞裂解物在冰上孵育30分钟，孵育后，将细胞裂解物以16， 900倍G离心20分钟，在4摄氏度下离心。同时，用冰冷的MP40裂解缓冲液平衡琼脂糖抗HA珠。每个样品使用15微升琼脂糖抗HA珠。
用200微升MP40裂解缓冲液洗涤磁珠，方法是在3， 000倍G的微量离心管中脉冲，在4摄氏度下搅拌一分钟。接下来，用移液管小心地吸出并丢弃上清液，并重复此过程三次。之后，将珠子保持在冰上平衡，直到使用。
离心细胞裂解物后，回收上清液并使用Bradford方法量化总裂解物中的蛋白质含量，以确保每个接受免疫沉淀的样品呈现等量的蛋白质。将必要体积的细胞裂解物与平衡的琼脂糖抗HA微球孵育四小时，在旋转培养箱中以四摄氏度轻轻旋转，这允许UXT-V2-HA与琼脂糖抗HA珠子结合。通过在微量离心管中以3， 000倍G在4摄氏度下脉冲一分钟来收集琼脂糖抗HA珠子。
小心地吸出并丢弃上清液。用冰冷的MP40细胞裂解缓冲液洗涤磁珠三次，用冰冷的FLAG HA缓冲液洗涤两次。最终洗涤后，使用移液管小心地除去所有上清液，并用在FLAG HA缓冲液上稀释的每毫升300微克HA肽洗脱多泛素化蛋白质。
将琼脂糖抗HA珠子与HA肽在四摄氏度下在摇摆摇床上孵育一小时。接下来，在4摄氏度下以3， 000倍G旋转珠子两分钟，并小心地除去含有多泛素化蛋白质的上清液。如有必要，将淋洗液储存在零下20摄氏度的新鲜干净的微管中。
将淋洗脱液和细胞裂解物在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹中溶解。要进行湿转印蛋白质印迹，请将凝胶置于由滤纸，凝胶膜滤纸组成的转印夹层中，用垫垫垫垫，然后通过支撑网格将其压在一起。然后，将此系统垂直放置在不锈钢或铂丝电极之间充满转移缓冲液的罐中。
在湿式传输缓冲液中，在 150 伏电压下进行 90 分钟的传输。最后，使用抗真菌抗体探测免疫印迹膜。在用抗真菌抗体探测来自抗HA免疫沉淀的淋洗液后，观察到由F-box蛋白7介导的UXT-V2-HA在细胞中的特异性多泛素化，该抗体检测与底物偶联的myc-ub。
在泳道1和2中可视化了抗真菌素对多泛素化底物的特异性，其中当细胞在没有UXT-V2-HA质粒的情况下与F-box蛋白7和myc-ub共转染时，未检测到多泛泛素蛋白的涂片。此外，在没有真菌-ub质粒的情况下，在F-box蛋白7和UXT-V2-HA的组合中，没有观察到对应于蛋白质多泛素化的涂片。当空载体野生型F盒蛋白7或F盒蛋白7突变体与UXT-V2-HA和myc-ub联合转染时，仅对野生型F盒蛋白7和细胞观察到多泛型UXT-V2的强烈涂片信号，表明与对照组相比，UXT-V2由SCF F-Box蛋白7复合物和细胞多泛素化。
单沉淀步骤，包括用平衡的磁珠孵育细胞裂解物和洗脱免疫沉淀蛋白对于实现该方案的目标至关重要。在该程序之后，应进行体外泛素化测定以确认E3连接酶的底物泛素化的特异性。
