用于线粒体疾病建模的人脑类器官的生成

该协议旨在使用脑类器官来研究线粒体疾病。它被开发用于产生可重复的脑类器官，以评估其线粒体特性。这种方法不需要昂贵的生物反应器和耗时的包埋程序。

因此，它易于实施和升级。该协议使得产生可重复的脑类器官并测试其线粒体特性成为可能。这可以导致识别无法治愈的线粒体疾病的介入靶标。

首先，在无饲养层条件下，在iPSC培养基中，在包被的六孔板上培养人iPSCs，并将其保存在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿组织培养箱中。使用无酶分离培养基以80%汇合度通过iPSCs，比例范围从1×4到12。为了提高细胞存活率，每次分裂后加入10微摩尔rho相关蛋白激酶或ROCK抑制剂。

在第 0 天解离 80% 的 iPSC。制备皮质分化培养基一或CDM1，并在将其添加到细胞之前在室温下预热。用PBS清洗含有iPSC的孔，以去除死细胞和碎屑。

向每个孔中加入500微升预热试剂A，并在37摄氏度下孵育5分钟。在显微镜下检查以确保细胞脱离。加入一毫升iPSC培养基以稀释试剂A以中和其活性。

使用1， 000微升移液器通过上下管道解离细胞，并将细胞悬浮液转移到15毫升离心管中。在室温下以125倍G轻轻离心iPSCs五分钟，然后小心地吸出上清液以避免干扰细胞沉淀。用一毫升CDM1重悬沉淀以获得单个细胞悬浮液并计数细胞数。

在CDM1中每100微升用9， 000 iPSCs制备接种培养基，并补充20微摩尔ROCK抑制剂，三微摩尔WNT连环蛋白抑制剂或IWR-1和5微摩尔SB-431542。将每孔100微升的接种培养基加入96孔V底板中。将板保持在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿组织培养箱中。

为了产生神经球，在第一天，观察具有明确平滑边界的圆形细胞聚集体正在形成。注意聚集体周围的死细胞。继续在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中培养。

在第三天，通过敲击侧面三次以分离死细胞来搅拌板，然后向每个孔中加入100微升CDM1，其中补充有20微摩尔ROCK抑制剂，三个微摩尔IWR-1和五个微摩尔SB-431542。将板保持在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。在第六天，小心地从每个孔中取出80微升的上清液培养基。

避免触摸井底。向每个孔中加入100微升CDM1，并补充有三个微摩尔IWR-1和五个微摩尔SB-431542并孵育板。每三天后重复上一步，直到第18天。

在第18天，为了转移神经球，准备CDM2并向100毫米超低附着细胞培养板中加入10毫升。使用200微升移液器，尖端被切断，将圆形神经球从96孔板转移到100毫米超低附着细胞培养板。从含有神经球的板中取出五毫升培养基，并加入五毫升新鲜的CDM2。

将板放在轨道振荡器上，在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿组织培养箱内以每分钟70次旋转。每三天，小心地吸出上清液培养基，并用新鲜的CDM2替换。留下少量培养基，以防止神经球变干。

在第35天，准备CDM3。从板中吸出培养基，加入10毫升冷CDM3。更换培养基后，将板放回轨道振荡器上，在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿组织培养箱内以每分钟70次旋转。

每三到五天更换培养基，具体取决于培养基颜色指示的生长速度。在第70天，准备CDM4。使用CDM4培养基，直到达到所需的类器官年龄。

在此期间，将板保持在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿组织培养箱内，每分钟旋转70次的轨道振荡器上。根据生长速度每三到五天更换一次培养基。准备4%PFA溶液并将其置于安全罩下。

收集脑类器官，并用钝头的三毫升塑料巴斯德移液管轻轻地将它们转移到充满PFA的六孔板中。将类器官在室温下在PFA溶液中保存一小时。用三毫升塑料巴斯德移液器小心地去除PFA，并使用PBS洗涤固定的类器官三次。

将固定的类器官储存在四摄氏度的PBS中，直到进一步使用。使用该协议生成的类器官包含成熟的神经元，可以使用轴突和树突特异性的蛋白质标记物进行可视化。成熟的类器官不仅含有神经元细胞，还含有神经胶质细胞。

使用切片的脑类器官分析，可以监测SMI 312阳性轴突和MAP2阳性树突或S100β神经胶质细胞。此外，共聚焦图像有助于研究 SOX2 阳性神经祖细胞相对于 β-3 微管蛋白阳性神经元的详细分布和组织。对脑类器官进行染色以检测线粒体特异性标志物，例如外膜转座酶或TOM20。

通过使用耗氧率（OCR）测量线粒体代谢和使用细胞外酸化速率或ECAR的糖酵解代谢来进行脑类器官的生物能量分析。寡霉素导致OCR谱下降，因此确定ATP生产所需的OCR。在寡霉素治疗后，ECAR也可能有代偿性增加，表明细胞可以上调糖酵解以防止代谢应激。

当将神经球从96孔板转移到培养板或在固定过程中时，轻轻处理类器官以避免损坏它们是至关重要的。在脑类器官生成之后，多电极阵列或钙成像将是测试类器官功能的理想方法。