基因组编辑细胞系细胞融合，用于细胞结构和功能的扰动

此方法允许细胞结构和功能通过两种不同细胞类型的融合来干扰，以解决细胞如何响应细胞器数量变化的问题。通过成像熔融细胞内的荧光标记蛋白质，细胞结构可以参考回细胞起源类型，以研究细胞平衡和功能的机制。对于荧光染料标签，请参阅感兴趣的人类癌细胞群，这样到第二天早上，每种培养体将至少扩大至六倍，达到第六细胞的70%至90%。

在贴标当天，用每次洗涤 10 毫升 PBS 洗涤根素 eGFP 和根素-mScarlet 细胞两次。将紫光细胞染料在PBS中稀释至500纳米摩尔，在PBS中稀释至200纳米摩尔。用稀释的紫罗兰细胞染料和根莱特-mScarlet细胞在室温下用稀释的远红细胞染料标记根素eGFP细胞一分钟。

在孵育结束时，停止与10毫升DMEM反应5分钟。用 10 毫升新鲜 PBS 清洗标记的细胞培养物和一个未标记的亲细胞培养物，然后用一毫升预谋的尝试性纤维素孵育所有培养物。在孵育结束时，将分离的细胞溶液转移到单个15毫升圆锥管中进行离心，并轻轻地将标记的染料颗粒重新在PBS的一毫升和未标记的细胞中，在一毫升DMEM中。

然后将所有细胞样本返回细胞培养箱。对于细胞融合实验，将500微升紫罗兰染料标记细胞与500微升远红染料标记细胞混合到新的15毫升管中，通过离心沉淀剩余的未混合标记细胞。将颗粒重新放入一毫升新鲜DMEM中，将细胞放回培养箱中。

通过离心收集混合细胞，并在30秒内以滴入颗粒中，以滴入700微升50%1450PEG。在室温下3.5分钟后，在30秒内加入10毫升无血清DMEM滴入，将管子放入培养箱10分钟。在孵化结束时，通过离心沉淀混合细胞，并轻轻地将颗粒重新悬浮在一毫升完整的介质中。

为了通过 FACS 丰富熔融细胞群，通过 70 微米滤株轻轻地将所有细胞过滤到单个 FACS 管中，并在 Cytometer 软件中创建正向散射与侧散射和双体分块。运行未标记的细胞以记录其荧光强度，并创建用于识别熔融细胞的门。接下来，运行单正紫红色染料标记细胞，以确认紫色信号没有溢出到远红色通道和单正远红染料标记细胞，以确认紫色信道中没有远红色信号。

然后短暂运行融合样本，以确认融合的细胞是否与这些门一起可见。设置分拣参数后，将分拣流集中对齐到包含 100 微升生长介质的八井成像盘中，并直接将双正融合细胞分类到培养皿中。当所有细胞都已分类后，立即将培养皿放入细胞培养箱中两到 16 小时。

对于免疫荧光染色，首先用200微升4%的半氟醛替换细胞培养上流剂，在室温下孵育15分钟。在固定结束时，每次洗涤用200微升PBS洗三次细胞，然后将细胞渗透在200微升0.1%非日象剂中，在室温下10分钟。接下来，在室温下用200微升3%牛血清白蛋白进行非特异性结合，在室温下30分钟，然后用150微升染色缓冲液中的抗体进行标记。

在室温下一小时后，在300微升PBS中清洗细胞两次，每次洗涤5分钟。上次洗涤后，用 200 微升新鲜 PBS 更换洗涤液。要获取融合细胞的图像，请使用能够进行四色成像的适当荧光显微镜并收集三维图像。

在流式细胞测量过程中，荧光信号在比未标记的控制细胞水平更高时可见适当标记的细胞。门可以设置为排序，以丰富双阳性细胞群体直接到成像盘进一步微观分析。融合通过将两个细胞混合成一个细胞，诱导细胞结构的主要重新排列。

异核子被确定为包含两个荧光染料信号的细胞，在单个细胞内混合，而不干预血浆膜。此外，在光明场成像的融合细胞中，也可以看到两个核。细胞结构和功能可以通过合并含有mGFP和mScarlet标记蛋白的细胞来进一步研究。

当分体四环成分NEDD1被荧光标记时，融合会导致异核体内可见的百分体数增加一倍，至少四分之一的半环物质。细胞与内源性荧光标记根蛋白的融合允许在异核生物中识别每个中心体的起源细胞。该协议演示了如何融合微分标记的细胞系，以及如何对细胞器进行成像，以了解其结构和功能。

与类似方法相比，这种健壮的协议相对容易，执行成本也相对低廉。这种技术可以用来提出一系列问题，例如细胞器融合是如何调节的，以及细胞对亚细胞细胞器数量的变化的反应。