Diese Methode ermöglicht es, zelluläre Struktur und Funktion durch die Fusion von zwei verschiedenen Zelltypen zu stören, um Fragen zu beantworten, wie Zellen auf Veränderungen der Organellenzahl reagieren. Durch die Abbildung fluoreszierend markierter Proteine in verschmolzenen Zellen können zelluläre Strukturen auf ihren Zelltyp zurückverwiesen werden, um die Mechanismen der Organellenhomöostase und -funktion zu untersuchen. Für die Fluoreszenz-Farbstoff-Etikettierung, siehe die menschlichen Krebszellpopulationen von Interesse, so dass jede Kultur wird sich auf mindestens sechs mal 10 zu den sechsten Zellen mit einer 70 bis 90% Konfluenz bis zum nächsten Morgen erweitert haben.
Am Tag der Etikettierung die Rootletin eGFP und Rootletin-mScarlet-Zellen zweimal mit 10 Milliliter PBS pro Wäsche waschen. Verdünnung violetter Zellfarbstoff auf 500 Nanomolar in PBS und Far Red Cell Farbstoff auf 200 Nanomolar in PBS. Beschriften Sie die Rootletin eGFP-Zellen mit dem verdünnten violetten Zellfarbstoff und die Rootletin-mScarlet-Zellen mit dem verdünnten Far Red Cell Farbstoff für eine Minute bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubationen, stoppen Sie die Reaktionen mit 10 Milliliter DMEM für fünf Minuten. Waschen Sie sowohl beschriftete Zellkulturen als auch eine unbeschriftete elterliche Zellkultur mit 10 Millilitern frischer PBS, bevor Sie alle Kulturen mit einem Milliliter vorgewärmten Trypsin bebrüten. Übertragen Sie am Ende der Inkubation die abgetrennten Zelllösungen zur Zentrifugierung auf einzelne 15 Milliliter Konikonröhren und setzen Sie die mit Farbstoffen beschrifteten Pellets in einem Milliliter PBS und die unbeschrifteten Zellen in einem Milliliter DMEM sanft wieder auf.
Geben Sie dann alle Zellproben an den Zellkultur-Inkubator zurück. Mischen Sie für Zellfusionsexperimente 500 Mikroliter violetter Farbstoff-beschrifteten Zellen mit 500 Mikroliterfarred-Farbstoff markierten Zellen in einem neuen 15-Milliliter-Rohr und sedimentieren Sie die verbleibenden ungemischten markierten Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie die Pellets in einem Milliliter frischem DMEM wieder aus und legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.
Sammeln Sie die gemischten Zellen durch Zentrifugation und fügen Sie 700 Mikroliter 50%1450 PEG in tropfenweiseer Weise zum Pellet über einen Zeitraum von 30 Sekunden hinzu. Nach 3,5 Minuten bei Raumtemperatur 10 Milliliter serumfreies DMEM tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Sekunden hinzufügen und die Schläuche für 10 Minuten in den Inkubator legen. Am Ende der Inkubation die Mischzellen durch Zentrifugation absedimentieren und das Pellet vorsichtig in einem Milliliter kompletten Medium sondienen.
Um die geschmolzene Zellpopulation durch FACS anzureichern, filtern Sie alle Zellen vorsichtig durch ein 70-Mikrometer-Sieb in einzelne FACS-Röhren und erzeugen Vorwärtsstreuung versus Seitenstreuung und doppelte Diskriminierungsdiagramme in der Zytometer-Software. Führen Sie die nicht beschrifteten Zellen aus, um ihre Fluoreszenzintensität aufzuzeichnen, und erstellen Sie Tore, um die verschmolzenen Zellen zu identifizieren. Führen Sie als Nächstes die einzelnen positiven violetten Farbfelder aus, um zu bestätigen, dass es kein Überstrahlen des Violettsignals in den Far Red-Kanal und die einzelnen positiven Far Red-Farbstoff-markierten Zellen gibt, um zu bestätigen, dass es kein Far Red-Signal im Violettkanal gibt.
Führen Sie dann kurz die Fusionsprobe aus, um zu bestätigen, dass die geschmolzenen Zellen mit diesen Toren sichtbar sind. Wenn die Sortierparameter eingestellt sind, richten Sie den Sortierstrom zentral in eine acht wellbildende Schale aus, die 100 Mikroliter Wachstumsmedium enthält, und sortieren Sie die doppelt positiven geschmolzenen Zellen direkt in die Schale. Wenn alle Zellen sortiert sind, legen Sie das Gericht sofort für zwei bis 16 Stunden in den Zellkultur-Inkubator.
Für immunfluoreszierende Färbung, ersetzen Sie zuerst die Zellkultur Überstand durch 200 Mikroliter von 4%Paraformaldehyd für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Fixierung die Zellen dreimal mit 200 MikroliterPBS pro Waschgang waschen, bevor sie die Zellen in 200 Mikroliter 0,1% nichtionisches Tensid bei Raumtemperatur 10 Minuten lang durchdringen. Als nächstes blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 200 Mikrolitern 3%rinderserumalbumin in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von der Kennzeichnung mit den interessierenden Antikörpern in 150 Mikroliter Färbepuffer.
Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Zellen zweimal in 300 Mikroliter PBS für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche die Wäsche durch 200 Mikroliter frisches PBS ersetzen. Um Bilder der geschmolzenen Zellen zu erfassen, verwenden Sie ein geeignetes Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, vierfarbige Bildgebung zu erhalten, und sammeln Sie dreidimensionale Bilder.
Entsprechend beschriftete Zellen sind während der Durchflusszytometrie durch fluoreszierendes Signal auf einer höheren Ebene als unbeschriftete Kontrollzellen sichtbar. Die Tore können für die Sortierung eingestellt werden, um für die doppelte positive Zellpopulation direkt in bildgebende Schalen für weitere mikroskopische Analysen anzureichern. Fusion induziert eine große Neuanordnung der zellulären Architektur durch das Mischen von zwei Zellen in eine.
Heterokaryonen werden als Zellen identifiziert, die beide fluoreszierenden Farbstoffsignale enthalten, die in einer einzigen Zelle gemischt werden, ohne Plasmamembranen einzugreifen. Darüber hinaus können zwei Kerne auch in geschmolzenen Zellen durch Brightfield-Bildgebung sichtbar sein. Die Zellstruktur und -funktion kann durch die Verschmelzung von Zellen, die meGFP und mScarlet markierte Proteine enthalten, weiter untersucht werden.
Die Fusion führt zu einer Verdoppelung der Zentrominzahl in Heterokaryonen, die als mindestens vier perizentrriolare Materialschwerpunkte sichtbar sind, wenn die zentromsome pericentriolar Komponente NEDD1 fluoreszierend markiert ist. Die Verschmelzung von Zellen mit endogen fluoreszierend getaggtem Rootletin ermöglicht die Identifizierung der Ursprungszelle jedes Zentromes in einem Heterokaryon. Dieses Protokoll zeigt, wie differenziell beschriftete Zelllinien verschmelzen und wie ihre Organellen abbilden, um ihre Struktur und Funktion zu verstehen.
Dieses robuste Protokoll ist im Vergleich zu ähnlichen Methoden relativ einfach und relativ kostengünstig durchzuführen. Diese Technik kann verwendet werden, um eine Reihe von Fragen zu stellen, wie organelle Fusion reguliert wird und wie die Zellen auf Veränderungen der subzellulären Organellenzahl reagieren.
