この方法により、細胞構造と機能を2つの異なる細胞タイプの融合を通じて摂動し、細胞がオルガネラ数の変化にどのように反応するかなどの質問に対処することができます。融合細胞内で蛍光タグ付きタンパク質をイメージングすることにより、細胞構造を細胞型の起源に戻して、オルガネラ恒常性および機能のメカニズムを研究することができます。蛍光色素標識については、各培養物が翌朝までに70~90%の合流度で6倍から6番目の細胞に拡大するように、目的のヒト癌細胞集団を参照してください。
ラベリングの日に、1回の洗浄につき10ミリリットルのPBSで、ルートレチンeGFPおよびルートレチン-mScarlet細胞を2回洗浄します。PBSでは500ナノモルにバイオレット細胞染料を希釈し、PBSでは200ナノモルに遠赤細胞色素を用いた。希釈したバイオレット細胞色素と、希釈したファーレッドセル色素を室温で1分間使用して、ラトレチンeGFP細胞にラベルを付けます。
インキュベーションの終わりに、 DMEM の 10 ミリリットルの反応を 5 分間停止します。1ミリリットルのプリウォームドトリプシンですべての培養物をインキュベートする前に、10ミリリットルの新鮮なPBSで標識された細胞培養と1つのラベル付けされていない親細胞培養の両方を洗浄する。インキュベーションの終わりに、分離した細胞溶液を遠心分離のために個々の15ミリリットルの円錐形チューブに移し、PBSの1ミリリットルの色素標識ペレットとDMEMの1ミリリットルの未標識細胞を穏やかに再中断する。
次に、細胞培養インキュベーターに全ての細胞試料を戻す。細胞融合実験では、新しい15ミリリットルチューブに500マイクロリットルのファーレッド色素標識細胞を用いてバイオレット色素標識細胞の500マイクロリットルを混合し、残りの混合されていない標識細胞を遠心分離によって沈下する。新鮮なDMEMの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、培養器に戻します。
遠心分離によって混合細胞を収集し、30秒間にわたってペレットにドロップワイズで50%1450 PEGの700マイクロリットルを追加します。室温で3.5分後、30秒間にわたって10ミリリットルの無血清DMEMを滴下し、チューブをインキュベーターに10分間入れます。インキュベーションの終了時に、遠心分離により混合細胞を沈下し、完全な培地の1ミリリットルでペレットを穏やかに再懸濁する。
FACSによる融合細胞集団を豊かにするために、70マイクロメートルのストレーナーを通して個々のFACSチューブにすべての細胞を穏やかにフィルタリングし、サイトメーターソフトウェアで前方散乱対側面散乱および二重識別プロットを作成する。ラベルなしの細胞を実行して蛍光強度を記録し、融合した細胞を識別するためのゲートを作成します。次に、単一の正のバイオレット染色標識セルを実行して、極赤チャネルへのバイオレット信号の波及がないことを確認し、バイオレットチャネルに遠赤色信号がないことを確認します。
次に、融合サンプルを簡単に実行して、融合した細胞がこれらのゲートで見えることを確認します。ソートパラメータが設定されたら、100マイクロリットルの成長培地を含む8ウェルイメージング皿に並べ替えストリームを中央に配置し、二重正の融合細胞を直接皿にソートします。すべての細胞が選別されたら、すぐに2〜16時間細胞培養インキュベーターに皿を入れます。
免疫蛍光染色の場合、まず細胞培養上清を200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドに置き換え、室温で15分間のインキュベーションを行います。固定の終了時に、200マイクロリットルの0.1%の非イオン性界面活性剤の細胞を室温で10分間透過させる前に、1回の洗浄につき200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。次に、PBSで3%のウシ血清アルブミンの200マイクロリットルで非特異的結合をブロックし、その後150マイクロリットルの染色バッファーに目的の抗体を標識した。
室温で1時間後、300マイクロリットルのPBSで細胞を1回5分間洗浄します。最後の洗浄後、洗浄物を200マイクロリットルの新鮮なPBSに交換してください。融合した細胞の画像を取得するには、4色イメージングが可能な適切な蛍光顕微鏡を使用し、3次元画像を収集します。
適切に標識された細胞は、フローサイトメトリー中に、非標識制御細胞よりも高いレベルで蛍光シグナルによって見える。ゲートは、二重正極細胞集団を直接イメージングディッシュに濃縮し、さらなる顕微鏡分析のために選別するように設定することができます。融合は、2つの細胞を1つに混合することによって細胞アーキテクチャの大きな再配置を誘導する。
ヘテロキロンは、細胞膜を介さずに単一細胞内に混合された蛍光色素信号の両方を含む細胞として同定される。さらに、2つの核も、ブライトフィールドイメージングによって融合細胞に見える可能性がある。細胞構造および機能は、meGFPおよびmScarletタグ付きタンパク質を含む細胞の結合を通じてさらに調査され得る。
融合は、中心期のペリセントリオラー成分NEDD1が蛍光的にタグ付けされると、少なくとも4つのペリセントリオラー物質病巣として見えるヘテロキリオン内のセントロソーム数の倍増をもたらす。細胞と内因的に蛍光的にタグ付けされた根型の細胞の融合により、各セントロソームの起源の細胞をヘテロカリオンで同定することができます。このプロトコルは、微分標識された細胞株を融合させる方法と、その構造と機能を理解するためにそれらのオルガネラを画像化する方法を示しています。
この堅牢なプロトコルは、類似の方法と比較して、比較的簡単で比較的安価です。この技術は、オルガネラ融合がどのように調節されているか、細胞内小器官数の変化にどのように反応するかなど、さまざまな質問に使用できます。
