Este método permite que a estrutura e a função celular sejam perturbadas através da fusão de dois tipos diferentes de células para abordar questões como como as células respondem às mudanças no número de organela. Por meio de proteínas fluorescentes marcadas fluorescentes dentro de células fundidas, as estruturas celulares podem ser referenciadas de volta ao seu tipo de origem celular para estudar os mecanismos da organela homeostase e função. Para rotular corantes fluorescentes, veja as populações de células cancerígenas humanas de interesse de tal forma que cada cultura terá se expandido para pelo menos seis vezes 10 para a sexta células em uma confluência de 70 a 90% até a manhã seguinte.
No dia da rotulagem, lave as células rootletin eGFP e rootletin-mScarlet duas vezes com 10 mililitros de PBS por lavagem. Diluir corante de células violetas a 500 nanomolares em PBS e corante de células vermelhas para 200 nanomolar em PBS. Rotule as células rootletin eGFP com o corante de células violeta diluída e as células rootletin-mScarlet com o corante diluído de células Far Red por um minuto à temperatura ambiente.
No final das incubações, pare as reações com 10 mililitros de DMEM por cinco minutos. Lave as culturas celulares rotuladas e uma cultura celular parental sem rótulos com 10 mililitros de PBS fresco antes de incubar todas as culturas com um mililitro de trippsina pré-armada. Ao final da incubação, transfira as soluções celulares separadas para tubos cônicos individuais de 15 mililitros para centrifugação e resuspenque suavemente as pelotas rotuladas de corante em um mililitro de PBS e as células sem rótulo em um mililitro de DMEM.
Em seguida, devolva todas as amostras de células para a incubadora de cultura celular. Para o experimento de fusão celular, misture 500 microliters de células rotuladas de corante violeta com 500 microliters de células rotuladas de corante Far Red em um novo tubo de 15 mililitros e sedimentar as células rotuladas não misturadas restantes por centrifugação. Resuspenda as pelotas em um mililitro de DMEM fresco e coloque as células de volta na incubadora.
Colete as células mistas por centrifugação e adicione 700 microliters de 50%1450 PEG de forma em gota à pelota durante um período de 30 segundos. Após 3,5 minutos em temperatura ambiente, adicione 10 mililitros de DMEM sem soro em forma de gota durante um período de 30 segundos e coloque os tubos na incubadora por 10 minutos. No final da incubação, sedimente as células mistas por centrifugação e resuspenque suavemente a pelota em um mililitro de meio completo.
Para enriquecer para a população celular fundida pela FACS, filtre suavemente todas as células em tubos FACS individuais através de um filtro de 70 micrômetros e crie dispersão dianteira versus dispersão lateral e parcelas de discriminação duplas no software do cítmetro. Execute as células não rotuladas para registrar sua intensidade de fluorescência e criar portões para identificar as células fundidas. Em seguida, execute as células rotuladas de corante Violeta positiva para confirmar que não há derramamento de sinal violeta no canal Far Red e as células rotuladas de corante far vermelho positivo para confirmar que não há sinal far vermelho no canal Violet.
Em seguida, execute brevemente a amostra de fusão para confirmar que as células fundidas são visíveis com esses portões. Quando os parâmetros de classificação tiverem sido definidos, alinhe o fluxo de classificação centralmente em um prato de imagem de oito poços contendo 100 microliters de meio de crescimento e classifique as células fundidas duplamente positivas diretamente no prato. Quando todas as células tiverem sido classificadas, coloque imediatamente o prato na incubadora de cultura celular por duas a 16 horas.
Para coloração imunofluorescente, substitua primeiro a cultura celular supernadante por 200 microlitres de 4% paraformaldeído para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente. Ao final da fixação, lave as células três vezes com 200 microliters de PBS por lavagem antes de permeabilizar as células em 200 microliters de 0,1% surfactante noniônico por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, bloqueie a ligação inespecífica com 200 microliters de 3% de albumina de soro bovino na PBS por 30 minutos à temperatura ambiente, seguida pela rotulagem com os anticorpos de interesse em 150 microliters de tampão de coloração.
Após uma hora em temperatura ambiente, lave as células duas vezes em 300 microliters de PBS por cinco minutos por lavagem. Após a última lavagem, substitua a lavagem por 200 microliters de PBS fresco. Para adquirir imagens das células fundidas, use um microscópio de fluorescência apropriado capaz de imagens de quatro cores e colete imagens tridimensionais.
Células adequadamente rotuladas são visíveis durante a citometria de fluxo por sinal fluorescente em um nível mais alto do que células de controle não rotuladas. Os portões podem ser definidos para triagem para enriquecer para a população celular dupla positiva diretamente em pratos de imagem para análise microscópica. A fusão induz um grande rearranjo da arquitetura celular através da mistura de duas células em uma.
Heterocayons são identificados como células contendo ambos os sinais de corante fluorescente misturados dentro de uma única célula sem intervir membranas plasmáticas. Além disso, dois núcleos também podem ser visíveis em células fundidas por imagens de Brightfield. A estrutura e função celular podem ser mais investigadas através da fusão de células contendo proteínas etiquetadas meGFP e mScarlet.
A fusão resulta em uma duplicação do número centralo dentro de heterocayons visíveis como pelo menos quatro focos de material pericentriolar quando o componente pericentriolar centrosome NEDD1 é marcado fluorescentemente. A fusão de células com rootletina marcada endogenosamente fluorescente permite que a célula de origem de cada centrosome seja identificada em um heterocaion. Este protocolo demonstra como fundir linhas celulares rotuladas diferencialmente e como imaginar suas organelas para entender sua estrutura e função.
Este protocolo robusto é relativamente fácil e relativamente barato de executar em comparação com métodos semelhantes. Esta técnica pode ser usada para fazer uma série de perguntas, como como a fusão de organela é regulada e como as células respondem a mudanças no número de organela subcelular.
