Bu yöntem, hücrelerin organel sayısındaki değişikliklere nasıl tepki verdiği gibi soruları yanıtlamak için iki farklı hücre türünün birleşmesi yoluyla hücresel yapı ve fonksiyonun tedirgin olmasını sağlar. Erimiş hücreler içinde floresan etiketli proteinlergörüntüleme ile, hücresel yapılar organel homeostaz ve fonksiyon mekanizmaları çalışma için kökeni kendi hücre tipine geri başvurulabilir. Floresan boya etiketleme için, her kültür en az altı kez 10 altıncı hücrelere ertesi sabah% 70-90 biraraya kadar genişletilmiş olacak gibi ilgi insan kanser hücresi popülasyonları bakın.
Etiketleme gününde, rootletin eGFP ve rootletin-mScarlet hücreleri yıkama başına 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de 500 nanomolar ve PBS'de 200 nanomolar için Far Red hücre boyasına seyreltin. Seyreltilmiş Menekşe hücre boyası ve rootletin-mScarlet hücreleri ile seyreltilmiş Uzak Kırmızı hücre boyası ile oda sıcaklığında bir dakika için rootletin eGFP hücreleri etiketleyin.
Kuluçkaların sonunda, 10 mililitre DMEM ile reaksiyonları beş dakika durdurun. Tüm kültürleri bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin ile kuluçkaya yatırmadan önce hem etiketli hücre kültürlerini hem de etiketsiz bir ebeveyn hücre kültürünü 10 mililitre taze PBS ile yıkayın. Kuluçka sonunda, müstakil hücre çözümlerini santrifüj için tek tek 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve pbs bir mililitre ve DMEM bir mililitre etiketsiz hücreleri yavaşça boya etiketli pelet ler yeniden askıya.
Sonra tüm hücre örneklerini hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Hücre füzyonu deneyi için, 500 mikrolitre Mor boya etiketli hücreleri 500 mikrolitre Far Red boya etiketli hücrelerle yeni bir 15 mililitrelik tüpte karıştırın ve kalan karıştırılmamış etiketli hücreleri santrifüj le çökün. Bir mililitre taze DMEM'deki peletleri yeniden askıya alın ve hücreleri tekrar kuvöze yerleştirin.
Santrifüj ile karışık hücreleri toplayın ve 30 saniye lik bir süre boyunca pelete damla şeklinde 50%1450 PEG 700 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 3,5 dakika kaldıktan sonra, 30 saniye lik bir süre boyunca 10 mililitre serumsuz DMEM damlası ekleyin ve tüpleri 10 dakika boyunca kuvöze yerleştirin. Kuluçka sonunda, santrifüj ile karışık hücreleri tortu ve yavaşça tam orta bir mililitre pelet resuspend.
FACS tarafından erimiş hücre popülasyonu için zenginleştirmek için, 70 mikrometrelik bir süzgeç aracılığıyla tüm hücreleri tek tek FACS tüpleri halinde hafifçe filtreleyin ve sitometre yazılımında yan dağılıma karşı ileri dağılım ve çift ayrımcılık çizimleri oluşturun. Floresan yoğunluğunu kaydetmek ve erimiş hücreleri tanımlamak için kapılar oluşturmak için etiketlenmemiş hücreleri çalıştırın. Daha sonra, Uzak Kırmızı kanala Violet sinyalinin dökülmediğini doğrulamak için tek pozitif Violet boya etiketli hücreleri ve Violet kanalında Uzak Kırmızı sinyali olmadığını doğrulamak için tek pozitif Far Red boya etiketli hücreleri çalıştırın.
Sonra kısa bir süre erimiş hücrelerin bu kapılar ile görünür olduğunu doğrulamak için füzyon örneği çalıştırın. Sıralama parametreleri ayarlandığında, sıralama akışını merkezi olarak 100 mikrolitre büyüme ortamı içeren sekiz kuyulu bir görüntüleme kabına hizalayın ve çift pozitif erimiş hücreleri doğrudan çanağa sıralayın. Tüm hücreler sıralandığında, hemen iki ila 16 saat boyunca hücre kültürü kuluçka içine çanak yerleştirin.
İmmünofloresan boyama için, ilk oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçka için% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ile hücre kültürü supernatant değiştirin. Fiksasyon sonunda, hücreleri yıkama başına 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0,1'lik noniyonik yüzey aktif maddenin 200 mikrolitresinde geçirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS'de %3'lük büyükbaş serum albuminin 200 mikrolitresi ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin ve ardından 150 mikrolitre boyama tamponunda ilgi antikorları ile etiketleyin.
Oda sıcaklığında bir saat sonra, yıkama başına beş dakika boyunca PBS 300 mikrolitre hücreleri iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 200 mikrolitre taze PBS ile yıkamayı değiştirin. Erimiş hücrelerin görüntülerini elde etmek için, dört renkli görüntüleme yeteneğine sahip uygun bir floresan mikroskobu kullanın ve üç boyutlu görüntüler toplayın.
Uygun şekilde etiketlenmiş hücreler akış sitometrisi sırasında floresan sinyal le etiketlenmemiş kontrol hücrelerinden daha yüksek bir düzeyde görülebilir. Kapılar daha fazla mikroskobik analiz için görüntüleme yemekleri doğrudan çift pozitif hücre popülasyonu için zenginleştirmek için sıralama için ayarlanabilir. Füzyon, iki hücrenin bir araya getirilmesi yoluyla hücresel mimarinin büyük bir yeniden düzenlenmesini sağlar.
Heterokaryonlar plazma membranları müdahale etmeden tek bir hücre içinde karışık hem floresan boya sinyalleri içeren hücreler olarak tanımlanır. Ayrıca, brightfield görüntüleme ile erimiş hücrelerde iki çekirdek de görülebilir. Hücre yapısı ve fonksiyonu daha fazla meGFP ve mScarlet etiketli proteinler içeren hücrelerin birleştirilmesi ile araştırılabilir.
Füzyon, sentrozom perisentriolar bileşen NEDD1 floresan etiketli olduğunda en az dört perisentrioler malzeme foci olarak görülebilir heterokaryoniçinde sentrozom sayısının iki katına çıkar. Endojen floresan etiketli rootletin ile hücrelerin füzyon her centrozsome kökeni hücre bir heterokaryon tespit edilmesine olanak sağlar. Bu protokol, farklı olarak etiketlenmiş hücre çizgilerini nasıl birleştirirken, organellerinin yapılarını ve işlevlerini anlamak için nasıl görüntüleneceğimi göstermektedir.
Bu sağlam protokol, benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında gerçekleştirmek için hem nispeten kolay hem de nispeten ucuzdur. Bu teknik, organel füzyonunun nasıl düzenlendiği ve hücrelerin hücre altı organel sayısındaki değişikliklere nasıl tepki verebildiği gibi bir dizi soru sormak için kullanılabilir.
