肝肿瘤细胞背景下自然杀伤细胞介导细胞毒性和迁移的测量

我们今天将演示两个协议，演示如何研究NK细胞功能。NK细胞功能有两个关键方面，就是能够根除肿瘤细胞，能够迁移到肿瘤微环境。这两个协议，我们将演示NK细胞的能力，以消除肿瘤细胞，也能够迁移到肿瘤微环境。

因此，我们今天要演示的两个协议是直接的，不需要使用无线电活动，可以在大多数实验室中建立，这些实验室有能力做分子生物学和细胞培养工作。苏雷什·布吉德和苏雷什·查瓦是我实验室的两位博士后同事，他们今天将演示这两个协议。两个评估NK细胞中化细胞毒性使用LDH，首先增长人类肝癌细胞系到70-80%的汇合在100毫米细胞培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳。

在实验当天，用五毫升PBS洗涤培养，然后用0.25%的尝试性EDTA的一毫升处理细胞，直到细胞从板底分离。获得单细胞悬浮液后，向细胞中加入10毫升细胞培养，并将细胞转移到15毫升锥形管中进行离心。用五毫升PBS洗涤细胞颗粒，然后以每毫升新鲜培养培养力浓度的1倍至第5个细胞重新悬浮细胞。

接下来，在96井板中每孔三升中目标人类肝癌细胞的100微升，并在100微升的培养中向每个靶细胞中加入10倍的10倍。然后将盘子放在细胞培养箱中三个小时。在孵化结束时，通过离心将细胞进行颗粒化，然后将100微升的上经剂从每口井转移到新96井板的单个孔中。

将 50 微升 LDH 基板添加到每井中，彻底混合，并在室温下孵育板 20 分钟，防止光线。在孵育结束时，用50微升停止溶液停止反应，并立即测量490和680纳米板读卡器的吸光度。然后使用公式计算 NK 细胞毒性百分比。

在将人类肝癌细胞系细胞培养至70-80%汇合后，使用钙蛋白计算细胞毒性，在室温下用1.5微升10毫升钙蛋白MM溶液对细胞进行再悬浮，并在室温下为细胞贴上1.5微升10毫升钙化蛋白溶液30分钟的标签。在孵育结束时，通过离心收集细胞，每次洗涤用五毫升PBS洗两次细胞。每毫升培养中等浓度的1倍至第5个细胞重新悬浮细胞，并在每个治疗条件下的96井板的每个井中加入100微升细胞。

接下来，在10至5个人类NK细胞中，在100微升培养基中，将细胞培养培养箱放在细胞培养箱中4小时。孵育结束后，在荧光显微镜上以10倍的放大倍率捕获钙素 AM 阳性细胞的至少 10 个不同图像，用于每个治疗条件的复制。然后使用公式计算细胞毒性百分比。

测量NK细胞迁移以响应化疗刺激从70-80%的汇合培养物中收集人类NK细胞，并在每毫升无血清NK细胞培养基浓度的2.5倍至第6细胞中重新悬浮细胞。接下来，加入600微升不含NK细胞化疗的无血清介质，每井都加入一个直径为6.5毫米的培养物，每孔有5微米孔。然后将100微升NK细胞添加到每个插入物的上部隔间，并将板放在细胞培养箱中4小时。

在孵化结束时，将整个非粘附细胞从每井底部转移到单独的五毫升的ACCS管中，并将50微升的预定数量的流式细胞仪计数珠添加到每个管中。然后使用流细胞计根据标准流量细胞计量分析方案评估每个细胞样本，并使用公式计算迁移的NK细胞的绝对数量。与表达非特异性短发夹RNA的NK细胞相比，ATF4击倒显著降低了NK细胞中占细胞毒性。

与没有NK细胞培养的人类肝癌细胞相比，与无NK细胞培养的人类肝癌细胞相比，用钙化物 AM 染色后，可行的人类肝癌细胞数量减少。正如预期的那样，ATF4通过短发夹RNA的敲击减少了NK细胞中占的人类肝癌细胞的杀戮，这些培养物中钙素 AM 阳性细胞的数量就更多就证明了这一点。此外，与暴露于无化疗素控制介质的NK细胞相比，对含化疗素的介质的NK细胞迁移量显著增加。

对于NK细胞毒性评估，重要的是要标准化我们的努力和目标比率和孵育时间的每一个癌细胞系。一旦标准被确定和验证，体外评估辅以体内小鼠实验，以进一步评估其在肿瘤细胞根除中的作用。