使用滑动运动蛋白运动度测定法制造多组分脂质纳米管网络

该协议允许简单生成大规模脂质纳米管网络，其中单个纳米管显示类似于母囊泡的相分离行为。这种方法的主要优点是，我们利用分子马达所做的工作，以高度平行的方式自组装脂质纳米管，而无需人为干预。要建立滑动运动度测定，首先，将三组双面胶带贴在相距五毫米的载玻片上。

轻轻地将盖玻片压在胶带上，并将30微升的一微摩尔驱动蛋白溶液加入制备的流通池中。五分钟后，将30微升10微克/毫升微管溶液加入细胞中，将实验室擦拭轻轻按压在流道的另一端，以促进溶液交换。再孵育五分钟后，每次洗涤用50微升室温动力溶液洗涤细胞一至三次，然后向流通池中加入30微升10微克/毫升链霉亲和素溶液。

10分钟后，加入30微升10X GUV溶液，在室温下孵育30分钟。然后，加入两微升100毫摩尔AMP-PNP溶液，并用密封剂关闭腔室。将流动室转移到倒置显微镜进行成像，并选择合适的滤光片组。

使用100X油物镜首先聚焦盖玻片的表面，然后再获取感兴趣网络的图像。然后在 ImageJ 中打开图像，然后单击“图像”、“颜色”和“合成”以叠加红色和绿色通道以创建复合图像。成像后，打开感兴趣的图像，然后单击“分析并设置比例”以校准显微镜的刻度。

将像素填充到千分尺转换因子，然后单击确定。使用多点线工具从母体GUV开始跟踪纳米管，并按住Control和M来测量长度。图像处理工具会将每个新测量结果保存在结果窗口中。测量完所有试管后，选择“图像”、“调整”和“阈值”，然后单击“应用”以应用阈值。

然后，在所需管子上绘制一个已知长度的矩形。要测量该区域的集成密度，请单击“分析并测量”以确定液体纳米管节点中的脂质分配，使用线工具在目标节点上绘制一条线，并测量绿色和红色通道中的节点强度。在这项代表性分析中，制备了液体纳米管网络，以产生液体无序和有序相，以及相分离的囊泡。

例如，用45%饱和脂质和55%不饱和脂质合成的囊泡导致囊泡分离成共存的液相和固相。然而，如果包括胆固醇，则可以观察到液 -液共存，从而产生分离成共存的液序和液态无序相的GUV。此外，可以在相分离的混合物中观察到节点。

要记住的最重要的事情是选择适当的曝光时间和ND滤光片集，以便能够可视化脂质纳米管而不会对荧光团进行光漂白。定制脂质纳米管的相行为组成使我们能够使用极简主义模型系统开始研究连接细胞的隧道纳米管的生物物理学。