人工脂质纳米管网作为内质神经的底部模型的自发形成与重排

内质性内质性内膜包含一个动态管状域，该管状域与细胞骨架不断相互作用，进行恒定的运动和重新排列。ER 如何生成和维护此组织尚未完全了解。在这里，我们提出了一个方便的问题，以形成一个自下而上的结构细胞器模型ER，其中包括一个固体支持的无蛋白质膜系统，可以转移到复杂的脂质纳米管网络。

亲水学是一种有机化合物，用于能量。不需要蛋白质纯化和蛋白质提取。唯一的基本组件是提供最基本的ER模型的固体基材和磷脂。

将溶解的脂质溶液转移到10毫升倒梨形烧瓶中，总计3000微克脂质和300微升氯仿。然后将烧瓶连接到旋转蒸发器，并倾斜 45 度。在23摄氏度的水浴中以24 RPM的转速旋转烧瓶6小时，降低气压，缓慢地完全去除氯仿。

启动旋转后，每两分钟开始降低压力 20 千帕，直到压力达到 20 千帕。六小时后，停止旋转，每两分钟以20千帕的步长再次增加气压，直到达到100千帕。从旋转蒸发器中去除烧瓶，加入三毫升 PBS 和 30 微升甘油。

轻轻旋转烧瓶溶解甘油。使用气密玻璃塞密封含有脂质的烧瓶。将烧瓶在四摄氏度的温度下过夜，用于补液和脂质薄膜的膨胀。

第二天，在室温下以35千赫的频率用超声波水浴对脂质进行声波化，直到达到均匀的轻微浊脂悬浮液。声波可以大约10到30秒。长时间的声波产生热量，不利于声层形成。

这些步骤产生包含两种类型的车辆结构的悬架。多酰胺囊泡和巨型单核囊泡。对于存储，使用总共 30 个微离心管将脂质悬浮液分成 100 微升等分。

将等分放在零下 20 摄氏度的冰柜中。不需要用液氮进行闪光冻结。解冻脂质悬浮液，将四微升悬浮液滴转移到干净的玻璃显微镜滑轨或盖滑上。

干燥20分钟后，液滴将坍塌成可见的脂质平圆膜。用一毫升的 HEPES 缓冲液重新补充脂质膜 3 分钟。使用开放顶部准备观察室，以便通过自动移液器进行缓冲交换，自动移液器需要启动文本协议中详述的 ER 变换。

用铲子取出固化的 PDMS 板后，使用手术刀将框架切割成适合显微镜阶段可用开口的尺寸和几何形状。1.5 % 1.5 by 0.5 厘米的尺寸适用于大多数设置。使 PDMS 框架的光滑侧与氧化铝薄膜所在的表面的有源侧接触，并轻轻施加压力，将框架和表面相互推动，使其粘附。

立即用钙 HEPES 缓冲液填充观察室。不要填充整个腔室体积，以允许在后续步骤中添加补水脂质。将腔室放在共合显微镜舞台上。

将含有巨型囊泡的悬浮液将补水脂质材料（现在含有巨型囊泡）转移到带塑料牧场移液器的室内。等待 10 到 20 分钟，让囊泡粘附在基材上并扩散到表面。在表面脂质沉积后，扩散立即开始。

在脂质扩散结构之前，必须尽可能轻轻地进行缓冲交换，快速去除或快速添加缓冲液扰动表面的脂质结构。观察多个脂质扩散后，通过自动移液器慢慢去除环境缓冲液。这样，底部仅保留一层薄缓冲膜。

注意避免快速清除。使用自动移液器缓慢地将观测室填充切合器 HEPES 缓冲器，继续进入环境缓冲器交换。避免突然添加。

最后一步产生动态纳米图状网络，形成由于溷合器诱导脱平和缩回多拉梅球囊体的结果。此处显示该协议中获得的纳米管网络的显微图。在此图像中，连续明亮的红色区域是 DLBM 的缩回分数，该分数标有蓝色虚线。

此处显示的是管状网络的显微图，该微图已反转以增加对比度。在这里，在3小时20分钟的过程内，管状密度的降低显示在膜区域。管密度的降低是由于逐渐去平，然后从表面缩回DLBM。

钙中位固定点的位置可以建立为管具有端子或急转弯的点。由于管对齐方向的突然移动，锐转弯称为 v 结或转弯。端点表示防止管缩回的管子的终点。

如果扩散持续很长时间，膜张力增加，导致破裂。由于脂质被荧光标记，因此可以直接观察到破裂。破裂的一个关键指标是破裂区域荧光强度显著下降。

样品完全脱水或缓冲液的快速交换会导致斑块的干扰、破裂或变形。通过添加 ER 相关成分（如脂质蛋白）可以建立模型的复杂性。该模型还可用于研究自组装、纳米流体、马兰戈尼流和运输现象。

氯仿有毒且挥发性高，应始终在烟罩下处理，并配有相关的个人防护设备，包括聚乙烯醋酸实验室手套、实验室外套和安全眼镜。