Este protocolo permite a simples geração de redes de nanotubos lipídes em larga escala em que os nanotubos individuais exibem comportamento de separação de fase semelhante ao da vesícula dos pais. A principal vantagem dessa abordagem é que cooptamos o trabalho feito pelos motores moleculares para auto-montar os nanotubos lipídicos de forma altamente paralela e sem intervenção humana. Para configurar um ensaio de motilidade deslizante, primeiro, afixe três conjuntos de tiras de fita de dois lados em um deslizamento de vidro a cinco milímetros de distância.
Pressione suavemente um deslizamento de tampa sobre a fita e adicione 30 microliters de uma solução de cinesina de um micromolar na célula de fluxo preparada. Após cinco minutos, adicione 30 microlitrais de uma solução de microtúbulo de 10 microgramas/mililitros na célula, pressionando um limpador de laboratório suavemente contra a extremidade oposta do canal de fluxo para facilitar a troca da solução. Após mais cinco minutos de incubação, lave a célula de uma a três vezes com 50 microliters de solução de motilidade de temperatura ambiente por lavagem antes de adicionar 30 microliters de 10 microgramas/mililiter streptavidin solução à célula de fluxo.
Após 10 minutos, adicione 30 microliters de uma solução GUV de 10X para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione dois microliters de uma solução AMP-PNP de 100 milimões e feche a câmara com selante. Transfira a câmara de fluxo para um microscópio invertido para imagens e selecione o conjunto de filtros apropriado.
Use um objetivo de óleo 100X para focar primeiro a superfície do deslizamento da tampa antes de adquirir uma imagem de uma rede de interesse. Em seguida, abra a imagem no ImageJ e clique em Imagem, Cor e Composto para sobrepor os canais vermelho e verde para criar uma imagem composta. Após a imagem, abra a imagem de interesse e clique em Analisar e Definir escala para calibrar a escala para o microscópio.
Preencha os pixels para o fator de conversão de micrômetros e clique em OK. Use a ferramenta de linha de vários pontos para rastrear os nanotubos a partir do GUV pai e pressione e segure Control e M para medir o comprimento. A ferramenta de processamento de imagens salvará cada nova medição na janela de resultados. Quando todos os tubos tiverem sido medidos, selecione Imagem, Ajuste e Limiar e clique em Aplicar o limiar.
Em seguida, desenhe um retângulo de comprimento conhecido sobre o tubo desejado. Para medir a densidade integrada da área, clique em Analisar e Medir Para determinar o particionamento lipídide nos nós do nanotubo líquido, use a ferramenta de linha para desenhar uma linha sobre o nó de interesse e medir a intensidade do nó nos canais verde e vermelho. Nesta análise representativa, foram fabricadas redes de nanotubos líquidos como demonstrado para gerar fases desordenadas e ordenadas por líquidos, bem como vesículas separadas em fase.
Por exemplo, vesículas sintetizadas com lipídios 45% saturados e lipídios 55% insaturados resultam em vesículas que se separam em fases coexistitárias e sólidas. Se o colesterol for incluído, no entanto, a coexistência líquido-líquido pode então ser observada, criando GUVs que se separam em fases coexistitárias de líquidos e desordenados líquidos. Além disso, os nós podem ser observados dentro das misturas separadas de fase.
A coisa mais importante a se lembrar é escolher o tempo de exposição adequado e o filtro ND definido para ser capaz de visualizar os nanotubos lipídides sem branquear fotos os fluoroforos. A adaptação da composição do comportamento de fase dos nanotubos lipídicos nos permite usar um sistema de modelo minimalista para começar a estudar a biofísica dos nanotubos de tunelamento que conectam as células.
