このプロトコルは、個々のナノチューブが親小胞の相分離挙動に類似した相分離挙動を示す大規模な脂質ナノチューブネットワークの単純な生成を可能にする。このアプローチの主な利点は、分子モーターによって行われる作業を取り入れて、脂質ナノチューブを高度に並列的に、人間の介入なしに自己組織化することです。滑空運動性アッセイを設定するには、まず、5ミリメートル離れたスライドガラスに3組の両面テープストリップを貼り付けます。
カバースリップをテープに静かに押し付け、調製したフローセルに30マイクロリットルの1マイクロモルのキネシン溶液を加える。5分後、30マイクロリットルの10マイクログラム/ミリリットル微小管溶液を細胞に加え、溶液交換を容易にするために流路の反対側の端に実験室ワイプを穏やかに押し当てる。さらに5分間のインキュベーションの後、30マイクロリットルの10マイクログラム/ミリリットルのストレプトアビジン溶液をフローセルに加える前に、洗浄ごとに50マイクロリットルの室温運動性溶液で細胞を1〜3回洗浄する。
10分後、30マイクロリットルの10X GUV溶液を加え、室温で30分間インキュベートする。次に、100ミリモルのAMP-PNP溶液を2マイクロリットル加え、シーラントでチャンバーを閉じます。フローチャンバをイメージング用の倒立顕微鏡に移し、適切なフィルタセットを選択します。
100Xオイル対物レンズを使用して、まずカバースリップの表面に焦点を合わせてから、目的のネットワークの画像を取得します。次に、ImageJ で画像を開き、「画像」、「カラー」、「合成」をクリックして、赤と緑のチャンネルを重ね合わせて合成画像を作成します。イメージング後、目的の画像を開き、[分析とスケールの設定]をクリックして、顕微鏡のスケールを校正します。
ピクセルをマイクロメーター変換係数に入力し、「OK」をクリックします。マルチポイントラインツールを使用して、親GUVから始まるナノチューブをトレースし、CtrlとMを長押しして長さを測定します。画像処理ツールは、新しい各測定値を結果ウィンドウに保存します。すべてのチューブが測定されたら、「画像」、「調整」、「しきい値」を選択し、「適用」をクリックしてしきい値を適用します。
次に、目的のチューブの上に既知の長さの長方形を描きます。領域の積分密度を測定するには、[分析と測定]をクリックして液体ナノチューブノードの脂質分配を決定し、線ツールを使用して目的のノードに線を引き、緑と赤の両方のチャネルでノード強度を測定します。この代表的な分析では、液体ナノチューブネットワークは、液体無秩序で秩序のある相、ならびに相分離された小胞を生成することが実証されたように作製された。
例えば、45%飽和脂質および55%不飽和脂質で合成された小胞は、共存する液体無秩序相および固相に分離する小胞をもたらす。しかし、コレステロールを含めると、液液の共存が観察され、共存する液体秩序相と液体無秩序相に分離するGUVが生成される。さらに、節は相分離混合物内で観察することができる。
覚えておくべき最も重要なことは、フルオロフォアを光退色することなく脂質ナノチューブを視覚化できるように、適切な露光時間とNDフィルターセットを選択することです。脂質ナノチューブの相挙動の組成を調整することで、最小限のモデルシステムを使用して、細胞をつなぐトンネルナノチューブの生物物理学の研究を開始することができます。
