细菌群的延时成像与集体压力反应

该协议可用于制作伪多莫纳斯aeruginosa群的延时电影，并捕获细菌或抗生素对蜂群的排斥。延时电影捕捉了大量对抗生素和噬菌体反应的详细动态，该技术只需要除湿机、计算机、孵化器和文档扫描仪。要为 P.aeruginosa 蜂长延时成像准备蜂拥的阿加片，请使用 25 毫升移液器在每个实验的 10 厘米直径 Petri 盘上添加 20 毫升的蜂拥糖溶液。

将板放在一个堆叠中，盖在室温下一小时。打开除湿机，将房间的相对湿度降低至40-50%当加糖凝固时，在层压流罩中再干燥蜂拥的阿加板30分钟，盖上盖子，以每分钟300立方英尺的速度朝上，室温下的相对湿度为40-50%。然后在4摄氏度下储存干蜂的阿加板长达24小时。

对于蜂拥的阿加电镀，握一个 P20 移液器尖端，装有五微升从隔夜 P.aeruginosa 培养，在一个蜂拥板中心上方 10-45 度角 2-1/2 厘米处，将柱塞压到仅液体掉落处接触 agar 的第一站。使用模板将点一致地定位在不同的蜂拥盘上。为了对噬菌体感染进行盘，首先将30微升过夜培养的P.aeruginosa与6微升混合，每毫升噬菌体DMS3 vir的12个斑块形成单位，并立即在2.8厘米半径同心圆的6个等距卫星位置添加6微升的P.aeruginosa噬菌体混合物。

使用模板将点一致地定位在不同的蜂拥盘上。要进行板式抗生素处理，将30微升过夜培养的P.aeruginosa与感兴趣的抗生素的适当浓度和体积混合，并立即在6个等距卫星位置的6个等距卫星位置，在菜盘中心周围2.8厘米半径的同心圆上添加6微升抗生素处理细菌。使用模板将点一致地定位在不同的蜂拥盘上。

当所有培养物都镀上时，用定制的黑色盖子替换清晰的培养皿盖。小心地将蜂拥的阿加板放在扫描仪上，在 37 摄氏度的培养箱中安装 10 升水浴，使湿度保持 75%。若要自动进行图像采集，请使用脚本软件。

选择空闲扫描和单次扫描，右键单击空闲扫描，然后左键单击启用。在孵化结束时，将所有扫描的图像导入 ImageJ。在序列选项窗口中，图像数将指示所选图像数。

将图像从一个图像开始，从文件夹中的第一张图片开始，将图像缩放为 100%，以保留图像的原始大小。单击"隐藏到 RGB"以保留图像的颜色。保留未选中使用虚拟堆栈，然后单击"确定"以加载映像。

单击文件，保存为 和 AVI 将图像合并到 AVI 文件中。将压缩调整为 JPEG，将帧速率调整为每秒五帧。然后将 AVI 延时保存在相应的存储文件夹中。

在37摄氏度的LB肉汤中，从LB的一个LB阿加板对一个野生型P.aeruginosa的单一殖民地进行延时成像，并发现进入蜂拥的阿加板的中心，发现在板块中心形成一个殖民地，从菌群径向扩散。沼泽从蜂拥的阿加板中心移动到外围，被感染噬菌体或用根塔霉素治疗的细菌发出的应激信号击退。单独在卫星位置发现的噬菌体或根塔姆霉素不会导致蜂拥而至的人口避开这些区域。

使用 25 毫升移液器，确保蜂拥的阿加板包含正好 20 毫升。根据实验室环境调整板材干燥时间也很重要。我们的技术使我们能够可视化伪多莫纳斯亚鲁吉诺萨种群的整体蜂群模式。

下一个目标是使用光明场显微镜监测单个细胞的活力。