使用植物来改善健康的实践可以追溯到几千年前。最近，需求增加，加上不可持续的收获做法和气候变化，给供应链带来压力。因此，植物掺假正日益成为人们关注的焦点，使植物鉴定成为质量控制中日益重要的一部分。
理想情况下，标识尽可能靠近源，以便可以有效地将资源分配给正确标识的材料。植物鉴定的方法有很多种。传统上，植物鉴定是通过形态评估和化学分析方法进行的。
形态学鉴定基于植物材料宏观和微观特征的差异。然而，它需要一个训练有素的植物学家，其应用粉状植物材料是有限的。化学分析方法广泛应用于药典和实验室，但由于仪器尺寸和环境要求，不理想的现场测试。
近年来，由于植物材料中基因组信息的高保真度和特异性，基因组方法已成为植物物种鉴定的替代技术。现在，分子诊断工具以便携式设备的形式提供，这种方法可用于现场应用。该协议的目标是在实验室设备和专门知识有限的情况下引入一种植物鉴定方法，例如使用便携式 qPCR 系统提供植物材料的农场。
几个世纪以来，马特里卡里亚香米拉，俗称德国洋甘菊，一直被用作促进健康的药物。为了证明目前方法的特异性，包括德国洋甘菊与其他常用的洋甘菊花（罗马洋甘菊）的区分进行比较。在德国洋甘菊农场中间演示了现场识别程序。
在具有平面和水平曲面的字段中设置一个测试区域。确定一种具有代表性的植物，该植物反映了洋甘菊花田中大多数植物的特征。使用无菌手套从代表性植物中挑选花头。
将样品放入 2.0 毫升收集管中。重复并收集同一植物约 0.5 至 0.7 厘米长的传单。将干浴孵化器预热至 95 摄氏度。
在每个采集管中，从植物DNA提取试剂盒中加入100微升的萃取溶液。为了更好的DNA提取效率，使用组织虫害研磨样品。合上管子。
确保在整个萃取过程中，提取溶液覆盖植物组织。将收集管放在预热干浴培养箱中，在 95 摄氏度下孵育收集管 10 分钟后，将收集管从干浴培养箱中取出。从DNA提取试剂盒中加入100微升稀释溶液，通过上下移液多次混合溶液。
重复相同的步骤进行传单提取。摇动以进一步混合溶液。植物问题通常不会在此处理后退化。
液体的颜色可能会改变，变得多云。根据表一配置 qPCR 仪器热循环条件，表一从初始变性的恒定温度步长开始，然后是 25 个放大周期，最后以温度斜坡结束，以获得高分辨率熔化曲线。使用前在室温下解冻表 2 中列出的 qPCR 主混合物和底向。
计划每个井中加载的反应。包含对目标物种的正对控制、非目标物种的正对等对等井、样本和阴性对等。在此示例中，使用 10 口井，5 口用于德国洋甘菊识别测试，另外 5 口用于罗马洋甘菊识别测试。
对于每种类型的物种鉴定测试，一口井包含从目标物种参考材料中提取的DNA阳性对照，一口井包含从非靶类物种参考材料中提取的DNA阳性对照，两口井中填充从田间提取的花叶DNA样本，一口井为阴性对照分配。表三描述了每种井型。根据每个植物物种鉴定测试的表四准备反应主组合。
典型的反应主混合包含通用 qPCR 主混合，两次，向前和反向物种特定的底剂，和无核酸酶水。使用前通过移液彻底混合反应母体混合物。将 PCR 反应盒面朝上放在平坦稳定的表面上。
根据此处定义的油井，将上一步配置的反应主混合物的 18 微升加载到墨盒井中。为进行本演示，将德国洋甘菊识别试验反应主混合添加到标有GC测试的井中，GCT在井中标有一、三、五、七、九，将罗马洋甘菊识别试验反应主混合到标有RC测试的井中，RCT在孔中标注二、四、六、八、十。从DNA提取管的上流液中转移两个微升的DNA样本，并预先提取DNA阳性对照器到预装 qPCR 主混合物的墨盒井中。
将每个 DNA 模板添加到 qPCR 主混合后，通过移液轻轻混合溶液。用胶粘膜小心地密封墨盒。将墨盒装到热循环室并关闭。
将 qPCR 仪器设置为运行。在目前的协议中，用于实时测量目标片段的放大。Ct 值定义为荧光信号跨过预定义阈值所需的周期数。
小于 25 个周期的 Ct 值被视为正放大。在这个数字中，罗马阳性控制只在罗马洋甘菊识别测试中放大，而在德国洋甘菊识别测试中没有放大。德国的洋甘菊阳性对照和现场样品只在德国洋甘菊鉴定测试中放大，而在罗马洋甘菊鉴定测试中没有放大。
在这两次测试中，阴性控制都没有放大。为了进一步确认阳性对控和样品中的具体扩增，在实验室中，每井中每一个井的PCR和产品的分数都运行在2%的气糖凝胶上。所有 Ct 值小于 25 的井都以预期尺寸生成安普利森，这与德国洋甘菊和罗马洋甘菊不同。
其余通道没有显示具体的放大产品，与现场测试中观察到的这些油井没有荧光信号一致。PCR 扩增后，使用用于监测荧光信号的相同软件进行了熔融曲线分析。随着温度的升高，双链安普利森开始分离，导致荧光强度降低。
荧光强度变化进一步转化为融化峰曲线，通过其特有的融化峰进一步区分德国洋甘菊与罗马洋甘菊。在这个数字中，德国洋甘菊正控的融化峰值为85.6摄氏度，与罗马洋甘菊正控的融化峰值不同。来自现场样品的PCR安普利森产生接近德国洋甘菊阳性控制的熔融峰。
现场样品的标识基于与控制装置匹配的特定放大和特征熔化温度确定。在此示例中，在田间收集的花和叶均被识别为德国洋甘菊马特里卡里亚洋甘菊。这两个样品的罗马洋甘菊测试结果为阴性。
该协议演示了使用便携式 qPCR 系统现场识别德国洋甘菊。我们可以开发类似的方法来扩大可以测试的植物组合。我们希望这个视频将为科学家，甚至非专家提供宝贵的培训材料，在实验室设备有限的领域或环境中进行植物鉴定。
基于DNA的现场鉴定测试不仅产生与实验室分析相匹配的高精度结果，而且减少了与实验室中的传统方法相关的时间和成本。
