该协议有助于制备和管理病毒和噬菌体鸡尾酒，以对抗斑马鱼胚胎中的伪单体亚鲁吉诺萨。这种技术的主要优点是，它允许在体内评估噬菌体在对抗细菌感染的功效。噬菌体鸡尾酒在野生型和囊性纤维化斑马鱼模型中都非常有效。
为囊性纤维化患者的细菌感染提供噬菌体治疗的可能性。噬菌体疗法也可以用于抵消其他模型系统中的特定细菌感染。为实验准备噬菌的植物。
将 1.25 倍 10 添加到第七噬菌体，加入 0.05 P.aeruginosa 培养的 OD 600，将 1 倍 10 的感染添加到负三，并在摇动下孵育培养素 3 到 4 小时，直到 OD 600 降至 0.1 至 0.3。在孵育结束时，在37摄氏度下用每毫升DNAAse和RNAAse1微克孵育1微克，孵育30分钟。通过离心对细胞进行造粒。
在离心过滤器的末尾，通过0.8微米的孔径过滤上清液，每升添加58克氯化钠和每升PEG 6000的105克。在四摄氏度下孵育溶液过夜。第二天早上，通过离心沉淀噬菌。
在中分液结束时去除上流液，小心地将噬菌酯颗粒溶解在15毫升的Tris氯化钠缓冲液中。为了通过氯化氯气密度梯度净化噬菌体，首先在聚体超离心管中分层四种不同氯化硅溶液的两毫升，用于 SW 41 转子，并将 3.5 毫升的噬菌体悬浮液添加到每个管中。氯化硅是有毒的。
处理和丢弃这种化合物时，始终采用适当的安全程序。当所有管已加载时，将管子放入转子中，注意管子是否平衡。在10万次g和4摄氏度下将样品离心两小时。
在离心结束时，使用带 19 量针的注射器吸入 D 等于 1.5 和 D 等于 1.4 密度区域之间的白色层。将悬浮液转移到新的 SW 60 尺寸聚体管中。在15万次g和4摄氏度下将悬浮液离心至少16小时。
将可见带转移到透析管中，有6000道尔顿截止。然后将收集的样品两次对500毫升水透析，每透析20分钟，对500毫升的三氯化钠缓冲液进行通宵透析。第二天早上，用0.22微米孔隙过滤器过滤产生的噬菌群，并在4摄氏度下储存。
在微注射当天稀释两个1微摩尔莫皮诺鱼库存溶液在无菌水中，最终浓度为0.25皮摩尔每个胚胎获得5微升莫皮诺注射溶液。并在每个溶液中加入0.5微升的酚红色。接下来使用带精细凝胶加载尖端的 20 微升微管，将微注射针装载到整个体积的 morpholino 混合溶液中，并固定针头到连接到立体显微镜下支架的微型机械手上。
然后用一个或两个细胞，斑马鱼胚胎放在一个玻璃幻灯片上，放置在一个96毫米直径的培养皿内，用微注射针尖穿透球和蛋黄，将两个纳米光的形态利诺混合物注入胚胎。受精后26小时，用大约5微升的P.aeruginosa inoculum装上微型注射针，并将针头插入Cuvier的导管起点，管道开始在蛋黄囊上蔓延。将PAO1中分的1至3纳米光注入胚胎，确保体积直接在导管内膨胀并进入循环。
注射后将胚胎移植到两个新的培养皿中，其中含有新鲜的E3培养皿，辅以苯丙胺，在28摄氏度下孵育30分钟或3小时。接下来，将一个带大约五微升的噬菌体鸡尾酒的微型注射针装上，然后将针头固定到微喷油器上。然后将一到三纳米的噬菌体鸡尾酒注射到以前注入细菌的每个胚胎的Cuvier的导管中，将胚胎放入两个新的培养皿中，其中含有新鲜的E3培养皿，并在28摄氏度下辅以苯乙基。
感染后四小时，使用塑料移液器将麻醉胚胎转移到玻璃底盘中。并填补菜与温暖的低熔点阿加罗斯溶液。当加糖是冷的，轻轻地填补与麻醉溶液补充E3介质的菜。
将培养皿放在立体显微镜下，并使用移液器尖端将胚胎置于所需方向。然后将培养皿置于荧光立体显微镜下，用荧光过滤器对GP阳性细菌进行长达18小时的感染后，并在感染后9小时、14小时和18小时对胚胎进行GP表达进展。为了确定感染后8小时的细菌负担，将15个麻醉微注射胚胎移植到1.5毫升离心管中，并在PBS中用300微升1%Triton X-100的麻醉液代替麻醉液。
将针头通过胰岛素注射器的无菌27表针至少15次，使胚胎均质。通过将所得混合物的100微升转移到900微升的无菌PBS中，准备对均质物进行连续稀释。为了选择天然氨基林耐药的P.aeruginosa菌株，将10微升的稀释剂放到LB agar上，并辅以氨基林，并在37摄氏度下孵育过夜。
第二天计算殖民地的数量。计算每个受感染胚胎的菌落形成单位总数和菌落形成单位的平均数量。为了评估P.aeruginosa感染的致命性，通过计算死白不透明胚胎的数量，在立体显微镜下对注射的胚胎进行评分。
然后计算半最大致命浓度50剂量的P.aeruginosa，导致50%的注射胚胎在感染后20小时死亡。为了验证囊性纤维化表型，可以评估心脏肝脏和胰腺等内脏器官的受损位置。感染P.Aeruginosa的囊性纤维化胚胎的噬菌体治疗减轻了细菌负担。
在受精后48小时内，感染GP阳性P.Aeroginosa细菌的囊性纤维化胚胎，每个胚胎剂量形成30个菌落，在感染后20小时内显示50%的致命性。当在细菌注射后30分钟或7小时进行时，噬菌体治疗在感染后20小时同样有效。在这里，囊性纤维化和GP阳性P.Aeruginosa注射胚胎在4，9，14和18小时后感染显示。
相比之下，囊性纤维化加上P.Aeruginosa加上噬菌体注射胚胎表明，由于噬菌体对细菌有作用，荧光减少。与对照注射斑马鱼相比，P.aeruginosa感染在囊性纤维化胚胎中产生的炎症反应显著增加，如在P.aeruginosa注射后，使用亲炎细胞因子、TNF alpha和白细胞间1β的表达。然而，在噬菌细胞联合注射的动物中，两种炎症细胞因子的表达减少。
必须仔细纯化噬菌体，以去除在制备过程中可能保留的任何污染内毒素。可以通过电子显微镜分析噬菌体制剂，以评估病毒形态。在囊性纤维化斑马鱼模型中，用噬菌体疗法来检测假多体白化病以外的细菌是否能够治愈人类患者的感染是很有趣的。
