פרוטוקול זה מקל על הכנה ומינהל של קוקטייל ויראלי ופאג ' נגד פסאודומונס aeruginosa בעוברים זברה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה in vivo של יעילות הפאג ' בניתוח הזיהום החיידקי. קוקטייל הפאג' יעיל הן בדגמי זברה-דגי סיסטיק פיברוזיס והן בדגמי זברה.
פתיחת האפשרות ליישם את הטיפול פאג' לזיהומים חיידקיים בחולים סיסטיק פיברוזיס. טיפול פאג' יכול להיות מיושם גם כדי לנטרל זיהומים חיידקיים ספציפיים במערכות מודל אחרות. כדי להכין מלאי פאג' לניסוי.
הוסף 1.25 פעמים 10 כדי פאג'ים השביעי OD 600 של 0.05 P.aeruginosa תרבות ריבוי של זיהום של פעם אחת 10 כדי שלילי שלוש דגירה התרבות במשך שלוש עד ארבע שעות עם רועד עד OD 600 יורד ל 0.1 כדי 0.3. בסוף הדגירה דגירה את הליזט עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של DNAse ו RNAse במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה.
בסוף מסנן הצנטריפוגה העל-טבעית בקוטר של 0.8 מיקרו מטר ומוסיפים 58 גרם לליטר נתרן כלורי ו-105 גרם לליטר PEG 6000. דגירה הפתרון בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לזרז את הפאג' על ידי צנטריפוגה.
בסוף centrofugation להסיר את supernatant בזהירות להמיס את גלולת פאג ב 15 מיליליטר של חיץ נתרן כלורי טריס. כדי לטהר את הפאג'ים על ידי שיפוע צפיפות צסיום כלוריד, תחילה לשכבות שני מיליליטר של ארבעה פתרונות שונים צסיום כלוריד בצינורות אולטרהצנטריפוגה פוליאלומר עבור SW 41 רוטור ולהוסיף 3.5 מיליליטר של השעיית פאג 'לכל צינור. צסיום כלוריד רעיל.
תמיד לאמץ נהלי בטיחות נאותים בעת טיפול והשליכה של מתחם זה. כאשר כל הצינורות נטענו, מניחים את הצינורות לתוך הרוטור דואג כי הצינורות מאוזנים. וצנטריפוגה הדגימות במשך שעתיים ב100, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.
בסוף הצנטריפוגה, השתמש במזרק עם מחט 19 מד כדי לשאוף את השכבה הלבנה בין D שווה 1.5 ו D שווה 1.4 אזורי צפיפות. ולהעביר את המתלים לצינורות פוליאלומר חדשים בגודל SW 60. צנטריפוגה ההשעיות לפחות 16 שעות ב 150, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס.
ולהעביר את הלהקות הנראות לעין לצינורות דיאליזה עם ניתוק של 6,000 דלטון. ואז דיאליזה הדגימות שנאספו פעמיים נגד 500 מיליליטר של מים במשך 20 דקות לדיאליזה ולינה נגד 500 מיליליטר של חיץ נתרן כלורי טריס. למחרת בבוקר, לסנן את מלאי פאג וכתוצאה מכך עם מסנן נקבוביות 0.22 מיקרו מטר ולאחסן את המלאי בארבע מעלות צלזיוס.
ביום של הזרקת מיקרו לדלל שני פתרונות מלאי morpholinos micromolar אחד במים סטריליים לריכוז סופי של 0.25 picomolar לכל עובר כדי לקבל פתרון הזרקת מורפולינו חמישה מיקרוליטר. ולהוסיף 0.5 microliters של פנול אדום לכל פתרון. לאחר מכן השתמש micropipette 20 microliter עם קצה טעינת ג'ל עדין לטעון מחט הזרקת מיקרו עם כל נפח של פתרון מעורב מורפולינו ולאבטח את המחט למיקרו מניפולטור מחובר לעמוד תחת מיקרוסקופ סטריאו.
ואז עם תא אחד או שניים, עוברי דגי זברה מסודרים על מגלשת זכוכית הממוקמת בתוך צלחת פטרי בקוטר 96 מ"מ, חודרים את הצ'וריון והחלמון עם קצה מחט הזרקת המיקרו ומזריקים שני ננוליטרים של תערובת המורפלינו לעובר. ב 26 שעות לאחר ההפריה, לטעון מחט הזרקת מיקרו עם כחמישה microliters של P.aeruginosa inoculum ולהכניס את המחט dorsally לנקודת ההתחלה של הצינור של קובייה שבו הצינור מתחיל להתפשט על שק החלמון. להזריק אחד עד שלושה nanoliters של PAO1 inoculum לתוך העובר לוודא כי נפח מתרחב ישירות בתוך הצינור ונכנס לתוך זרימת הדם.
לאחר ההזרקה מעבירים את העובר לאחת משתי מנות פטרי חדשות המכילות מדיום E3 טרי בתוספת פנילטוריה במשך 30 דקות או שלוש שעות דגירה ב 28 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לטעון מחט הזרקת מיקרו עם כחמישה microliters של קוקטייל פאג 'ולתקן את המחט למזרק מיקרו. ואז להזריק אחד עד שלושה nanoliters של קוקטייל פאג ' לתוך הצינור של קובייה של כל עובר שהוזרק בעבר עם חיידקים ולמקום את העוברים לתוך אחת משתי מנות פטרי חדש המכיל טרי E3 בינוני בתוספת phenylthiourea ב 28 מעלות צלזיוס.
בארבע שעות לאחר ההדבקה, השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר עובר הרדמה לצלחת תחתונה מזכוכית. ולמלא את המנה עם תמיסת נקודת התכה נמוכה וחמה. כאשר אגרוז קר, בעדינות למלא את המנה עם E3 בינוני בתוספת פתרון הרדמה.
מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ולהשתמש קצה פיפטה כדי למקם את העובר בכיוון הרצוי. לאחר מכן מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם מסנן פלואורסצנטי עבור חיידקים חיוביים GFP עד 18 שעות לאחר ההדבקה ודמיין את העובר להתקדמות ביטוי GFP בגיל תשע, 14 ו -18 שעות לאחר ההדבקה. כדי לקבוע את הנטל החיידקי בשמונה שעות לאחר ההדבקה, להעביר 15 עוברים מוזרקים מיקרו הרדמה לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולהחליף את הפתרון ההרדמה עם 300 microliters של 1% טריטון X-100 ב PBS.
להעביר את המחטים דרך מחט סטרילית 27 מד של מזרק אינסולין לפחות 15 פעמים כדי הומוגניזציה העוברים. והכן דילול סדרתי של הומוגניט על ידי העברת 100 microliters של התערובת וכתוצאה מכך לתוך 900 microliters של PBS סטרילי לכל דילול. כדי לבחור עבור זן P.aeruginosa עמיד באופן טבעי, צלחת 10 microliters של דילול על LB אגר בתוספת אמפיצילין דגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת לספור את מספר המושבות. כדי לאפשר חישוב של המספר הכולל של יחידות יוצרות המושבה ואת המספר הממוצע של יחידות יוצרות מושבה לכל עובר נגוע. כדי להעריך את הקטלניות של זיהום P.aeruginosa ציון העוברים מוזרק ב 20 שעות לאחר זיהום תחת מיקרוסקופ סטריאו על ידי ספירת מספר עוברים אטומים לבנים מתים.
ואז לחשב את הריכוז הקטלני חצי מקסימלי 50 מנה של P.aeruginosa שהביא למוות של 50% של העוברים מוזרק ב 20 שעות לאחר ההדבקה. כדי לאמת את פינוטיפ סיסטיק פיברוזיס את המיקום לקוי של איברים פנימיים כגון כבד הלב והלבלב ניתן להעריך. הנטל החיידקי מצטמצם על ידי טיפול פאג' בעוברים סיסטיק פיברוזיס נגוע P.Aeruginosa.
ב 48 שעות לאחר הפריה סיסטיק פיברוזיס עוברים נגועים GFP חיובי P.Aeroginosa חיידקים 30 מושבה להרכיב יחידות לכל מינון העובר מדגים קטלניות 50% ב 20 שעות לאחר ההדבקה. טיפול פאג' יעיל באותה מידה ב 20 שעות לאחר ההדבקה כאשר נמסר 30 דקות או שבע שעות לאחר הזרקת חיידקים. כאן, סיסטיק פיברוזיס ו GFP חיובי P.Aeruginosa מוזרק עובר בארבע, תשע, 14 ו 18 שעות לאחר ההדבקה מוצג.
לעומת זאת, סיסטיק פיברוזיס בתוספת P.Aeruginosa בתוספת פאג' מוזרק עובר מדגים פלואורסצנטיות מופחתת עקב פעולת פאג 'נגד החיידקים. התגובה הדלקתית שנוצרת על ידי זיהום P.aeruginosa בעוברים סיסטיק פיברוזיס גדל באופן משמעותי כפי שנחשף על ידי הביטוי של ציטוקינות פרו דלקתיות, אלפא TNF ו interleukin 1 בטא בעקבות הזרקת P.aeruginosa לעומת שליטה מוזרק זברה. הביטוי של שני ציטוקינות דלקתיות מצטמצם בקוקטייל פאג' במשותף בעלי חיים עם זאת.
יש לטהר את הפאג'ים בזהירות כדי להסיר כל אנדוטוקסין מזהם שעשוי להישמר במהלך ההכנה. ההכנות פאג ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים כדי להעריך את מורפולוגיה virion. זה יהיה מעניין לבדוק אם הזיהום בחולים אנושיים על ידי חיידקים אחרים מאשר pseudomonas aeruginosa ניתן לרפא עם טיפול פאג 'במודל סיסטיק פיברוזיס זברה.
