이 프로토콜은 제브라피시 배아의 슈도모나스 아에루기노사에 대한 바이러스 및 파지 칵테일의 준비 및 투여를 용이하게합니다. 이 기술의 주요 장점은 세균 감염에 중화되는 파지 효능의 생체 내 평가를 허용한다는 것입니다. 파지 칵테일은 야생 유형과 낭포성 섬유증 제브라피시 모델 모두에서 효율적입니다.
낭포성 섬유증 환자의 세균 감염에 파지 요법을 적용 할 수있는 가능성을 열어. 파지 치료는 또한 그밖 모형 시스템에서 특정 세균성 감염을 중화하기 위하여 적용될 수 있습니다. 실험을 위한 파지 스톡을 준비합니다.
1.25배 10번을 0.05 P.aeruginosa 배양의 OD 600에 첨가하여 10배의 감염의 복합성에 10배의 감염성을 부정3로 나누고 OD 600이 0.1에서 0.3으로 떨어질 때까지 흔들어 서 3~4시간 동안 배양한다. 인큐베이션의 끝에서 37섭씨에서 30분 동안 DNAse및 RNA의 밀리리터당 1마이크로그램으로 용액을 배양합니다. 그리고 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
원심분리의 끝에서 0.8 마이크로 미터 모공 직경을 통해 상피필터를 걸러내고 염화나트륨 리터당 58그램, PEG 6000 리터당 105그램을 추가합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 솔루션을 배양하십시오. 다음 아침, 원심분리로 파지를 침전시합니다.
센트로푸게이션의 끝에서 상체를 제거하고 조심스럽게 트리스 나트륨 염화 나트륨 버퍼의 15 밀리리터에 파지 펠릿을 용해. 세슘 염화물 밀도 그라데이션에 의해 파지를 정화하기 위해 먼저 SW 41 로터용 폴리알로머 초센트리슈에지 튜브에 4개의 다른 세슘 염화제 용액의 2밀리리터를 계층화하고 각 튜브에 파지 서스펜션3.5 밀리리터를 추가합니다. 염화물 세슘은 독성이 있습니다.
이 화합물을 취급하고 폐기할 때 항상 적절한 안전 절차를 채택하십시오. 모든 튜브가 로드되면 튜브가 균형을 이루는 것을 주의하여 튜브를 로터에 넣습니다. 그리고 100, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 2 시간 동안 샘플을 원심 분리합니다.
원심분리의 끝에서, D와 같고 D는 1.4 밀도 영역과 같을 사이의 백색 층을 흡인하기 위해 19 게이지 바늘을 가진 주사기를 사용한다. 그리고 새로운 SW 60 크기의 폴리 알로머 튜브로 서스펜션을 전송합니다. 150, 000배, 섭씨 4도에서 최소 16시간 동안 서스펜션을 원심분리합니다.
그리고 6, 000 달튼 컷오프와 투석 튜브로 보이는 밴드를 전송합니다. 그런 다음 수집된 샘플을 투석당 20분 동안 500밀리리터의 물에 대해 두 번, 트리스 나트륨 염화물 버퍼 500밀리리터에 대해 하룻밤 동안 투석을 합니다. 다음 아침, 0.22 마이크로 미터 모공 필터로 생성 된 파지 스톡을 필터링하고 섭씨 4도에 재고를 저장합니다.
마이크로 주입당일에는 멸균수에 있는 2개의 마이크로몰라 모르폴리노스 스톡 용액을 배아당 0.25 피코몰라의 최종 농도로 희석하여 5개의 마이크로리터 모르폴리노 주입 용액을 얻었다. 그리고 각 솔루션에 페놀 레드의 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로 미세겔 로딩 팁이 있는 20마이크로리터 마이크로파이프를 사용하여 모폴리노 혼합 용액의 전체 부피와 함께 마이크로 사출 바늘을 적재하고 스테레오 현미경 아래 스탠드에 연결된 마이크로 조작기로 바늘을 고정시킵니다.
그런 다음 하나 또는 두 개의 세포로, 얼룩말 물고기 배아는 96 밀리미터 직경 페트리 접시 내에 배치 유리 슬라이드에 배치, 마이크로 주입 바늘 팁으로 초리온과 노른자를 관통하고 배아에 모르플리노 혼합물의 두 나노 리터를 주입. 수정 후 26시간, P.aeruginosa inoculum의 약 5개의 마이크로리터를 가진 마이크로 사출 바늘을 적재하고 덕트가 노른자 낭 위로 퍼지기 시작하는 쿠비에의 덕트의 시작지점에 바늘을 등갈기로 삽입한다. PAO1 접종의 1~3나노리터를 배아에 주입하여 부피가 덕트 내에서 직접 확장되어 순환으로 진입하도록 합니다.
주사 후 배아는 28°C에서 30분 또는 3시간 동안 페닐티우레아로 보충된 신선한 E3 배지를 함유한 두 개의 새로운 페트리 요리 중 하나로 배아를 전달한다. 다음으로, 파지 칵테일의 약 5 마이크로 리터와 마이크로 주입 바늘을로드하고 마이크로 인젝터에 바늘을 고정. 그런 다음 이전에 박테리아를 주입한 각 배아의 Cuvier 덕트에 파지 칵테일 1~3나노리터를 주입하고 28°C에서 페닐티우레아로 보충된 신선한 E3 배지를 함유한 두 개의 새로운 페트리 요리 중 하나에 배아를 배치합니다.
감염 후 4시간 동안 플라스틱 파이펫을 사용하여 마취된 배아를 유리 바닥 접시에 옮기습니다. 그리고 따뜻한 낮은 융점 아가로즈 용액으로 접시를 채웁니다. 아가로즈가 차가워지면 마취용액으로 보충된 E3 배지로 접시를 부드럽게 채웁니다.
스테레오 현미경 아래에 접시를 놓고 파이펫 팁을 사용하여 배아를 원하는 방향으로 배치합니다. 그런 다음 GFP 양성 박테리아에 대한 형광 필터를 사용하여 형광 스테레오 현미경으로 접시를 감염 후 최대 18시간 동안 배치하고 감염 후 9시간, 14 시간 및 18시간 후GFP 발현의 진행을 위한 배아를 이미지화한다. 감염 후 8시간에서 세균 부담을 결정하기 위해 15개의 마취된 미세 주입 배아를 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 PBS에서 1%트리톤 X-100의 300마이크로리터로 마취용액을 대체한다.
인슐린 주사기의 멸균 27 게이지 바늘을 통해 바늘을 통과하여 배아를 균질화합니다. 그리고 희석당 멸균 PBS의 900 마이크로리터로 생성된 혼합물의 100 마이크로리터를 이송하여 동형화의 직렬 희석을 준비한다. 자연암피실린 내성 P.aeruginosa 균주를 선택하려면, 암피실린으로 보충된 LB 한루에 희석제 10 마이크로리터를 플레이트하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
다음 날은 식민지 의 수를 계산합니다. 감염된 배아당 식민지 형성 단위의 총 수와 평균 식민지 형성 단위수를 계산할 수 있도록 한다. P.aeruginosa 감염의 치사성을 평가하기 위해 죽은 백색 불투명 배아의 수를 계산하여 스테레오 현미경의 밑에 20 시간 감염 후 감염에서 주입된 배아점수.
그런 다음 감염 후 20시간 동안 주입된 배아의 50%가 사망한 P.aeruginosa의 절반 최대 치명적인 농도 50회 투여량을 계산합니다. 낭포성 섬유증 표현형을 검증하기 위해 심장 간 및 췌장과 같은 내부 장기의 손상된 위치를 평가할 수 있다. 세균성 부담은 P.Aeruginosa에 감염된 낭포성 섬유증 태아에 있는 파지 치료에 의해 감소됩니다.
GFP 양성 P.Aeroginosa 박테리아에 감염된 48 시간 후 수정 낭포성 섬유증 배아배는 배아 복용량 당 30 식민지 형성 단위는 감염 후 20 시간에서 50 %의 치사성을 보여줍니다. 파지 치료는 세균 주사 후 30 분 또는 7 시간을 전달할 때 감염 후 20 시간에서 동등하게 효과적입니다. 여기서, 낭포성 섬유증 및 GFP 양성 P.Aeruginosa는 4, 9, 14 및 18 시간 후 감염에서 배아를 주입하는 것을 보여 주었다.
대조적으로 낭포성 섬유증 플러스 P.Aeruginosa 플러스 파지 주입 태아는 박테리아에 대하여 파지 작용 때문에 감소된 형광을 보여줍니다. 낭포성 섬유증 배아에서 P.aeruginosa 감염에 의해 생성된 염증 반응은 프로 염증성 사이토카인, TNF 알파 및 인터류킨 1 베타 다음의 발현에 의해 밝혀지면서 현저히 증가하며 P.aeruginosa 주사에 비해 주사된 제브라피시 대조군에 비해. 그러나 파지 칵테일공동 주입 동물에서 두 염증성 사이토카인의 발현이 감소된다.
파지는 준비 중에 유지될 수 있는 오염된 내독신을 제거하기 위해 신중하게 정제되어야 합니다. 파지 제제는 전자 현미경 검사법에 의해 분석되어 비리온 형태를 평가할 수 있다. 가짜 아에루기노사 이외의 박테리아에 의한 인간 환자의 감염이 낭포성 섬유증 얼룩말피 모델에서 파지 요법으로 치료될 수 있는지 여부를 테스트하는 것은 흥미로할 것입니다.
