Bu protokol zebra balığı embriyolarında pseudomonas aeruginosa karşı viral ve faj kokteylhazırlanması ve uygulanması kolaylaştırır. Bu tekniğin en büyük avantajı, bakteriyel enfeksiyonla mücadelede faj etkinliğinin in vivo bir değerlendirmesini sağlamasıdır. Faj kokteyli hem yabani tip hem de kistik fibrozis zebrabalığı modellerinde etkilidir.
Kistik fibrozis hastalarında faj tedavisinin bakteriyel enfeksiyonlara uygulanması imkanının açılması. Faj tedavisi de diğer model sistemlerinde belirli bakteriyel enfeksiyonları niçin karşı koymak için uygulanabilir. Deney için bir faj stoku hazırlamak için.
0.05 P.aeruginosa kültürünün bir kat10'luk enfeksiyonuna 7. Kuluçka sonunda 37 santigrat derece 30 dakika boyunca DNAse ve RNaE mililitre başına bir mikrogram ile lysate inkübat. Ve santrifüj ile hücreleri pelet.
Santrifüj filtresisonunda 0,8 mikro metre gözenek çapı ile supernatant ve peg 6000 litre başına sodyum klorür litre başına 58 gram ekleyin. Çözeltiyi bir gecede 4 derece yedirin. Ertesi sabah, fajı santrifüjle çökeltin.
Santrifüj sonunda supernatant kaldırmak ve dikkatle Tris sodyum klorür tampon 15 mililitre faj pelet eritin. Sezyum klorür yoğunluğu gradyanı ile fajları arındırmak için, ilk bir SW 41 Rotor için poliallomer ultracentrifuge tüplerdört farklı sezyum klorür çözeltisi iki mililitre tabakalı ve her tüp için faj süspansiyon 3.5 mililitre ekleyin. Sezyum klorür zehirlidir.
Bu bileşiği işlerken ve atırken her zaman uygun güvenlik prosedürlerini uygulayın. Tüm tüpler yüklendiğinde, tüplerin dengeli olduğuna dikkat edin, tüpleri rotora yerleştirin. Ve örnekleri 100, 000 kez g ve dört santigrat derecede iki saat santrifüj edin.
Santrifüjsonunda, D arasındaki beyaz tabaka 1,5 ve D 1,4 yoğunluk bölgeleri eşittir arasındaki beyaz tabaka aspire etmek için 19 gauge iğne ile bir şırınga kullanın. Ve yeni SW 60 boyutunda poliallomer tüpler içine süspansiyonlar aktarın. Süspansiyonları 150, 000 kez g ve dört santigrat derecede en az 16 saat santrifüj edin.
Ve görünür bantları 6,000 Dalton kesiğiyle diyaliz tüplerine aktarın. Daha sonra toplanan numuneleri diyaliz başına 20 dakika boyunca 500 mililitre suya karşı iki kez ve bir gecede 500 mililitre Tris sodyum klorür tamponuna karşı diyalize koyun. Ertesi sabah, ortaya çıkan faj stoğunu 0,22 mikro metre gözenek filtresi ile filtreleyin ve stoku dört santigrat derecede saklayın.
Mikro enjeksiyon gününde beş mikrolitre morfolino enjeksiyon çözeltisi elde etmek için embriyo başına 0,25 picomolar nihai konsantrasyona steril suda iki bir mikromolar morpholnos stok çözeltileri seyreltmek. Ve her çözeltiye 0,5 mikrolitre fenol kırmızısı ekleyin. Sonraki morpholino karışık çözelti tüm hacmi ile bir mikro enjeksiyon iğnesi yüklemek ve bir mikro manipülatör bir stereo mikroskop altında bir standbağlı bir mikro manipülatör için iğne güvenli ince jel yükleme ucu ile 20 mikrolitrelik mikropipet kullanın.
Sonra bir veya iki hücre ile, zebra balık embriyoları bir cam slayt üzerinde düzenlenmiş 96 milimetre çapında Petri çanak içine yerleştirilen, mikro enjeksiyon iğne ucu ile chorion ve sarısı nüfuz ve embriyo içine morphlino karışımı iki nanolitre enjekte. 26 saat sonra döllenme, P.aeruginosa inoculum yaklaşık beş mikrolitre ile bir mikro enjeksiyon iğnesi yükleyin ve kanal yumurta kesesi üzerinde yayılmaya başlar Cuvier kanalının başlangıç noktasına iğne dorsally takın. Embriyoiçine PAO1 inoculum bir ila üç nanolitre enjekte hacim doğrudan kanal içinde genişler ve dolaşıma girer emin olun.
Enjeksiyondan sonra 28 santigrat derecede 30 dakika veya üç saatlik kuluçka için fenilthiourea ile takviye taze E3 orta içeren iki yeni Petri bulaşıkbirine embriyo transferi. Daha sonra, faj kokteyli yaklaşık beş mikrolitre ile bir mikro enjeksiyon iğnesi yükleyin ve mikro enjektör için iğne düzeltmek. Daha sonra daha önce bakteri enjekte her embriyocu kanalına faj kokteyli bir ila üç nanolitre enjekte ve 28 santigrat derece fenilthiourea ile desteklenen taze E3 orta içeren iki yeni Petri yemekleri içine embriyolar yerleştirin.
Enfeksiyon dan sonra dört saat, bir cam alt çanak içine anestezi embriyo aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Ve sıcak düşük erime noktası agarose çözeltisi ile çanak doldurun. Agarose soğuk olduğunda, yavaşça anestezik çözelti ile takviye E3 orta ile çanak doldurun.
Yemeği stereo mikroskobun altına yerleştirin ve embriyoyu istenilen yönde konumlandırmak için bir pipet ucu kullanın. Daha sonra, 18 saate kadar enfeksiyon sonrası GFP pozitif bakteriler için floresan filtre ile bir floresan stereo mikroskop altında çanak yerleştirin ve dokuz, 14 ve 18 saat post-enfeksiyon gfp ifade ilerlemesi için embriyo görüntü. Enfeksiyon sonrası sekiz saat bakteriyel yükü belirlemek için, 15 anestezik mikro enjekte edilmiş embriyoyu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve anestezik solüsyonu PBS'de %1 Triton X-100'ün 300 mikrolitresiyle değiştirin.
Embriyoları homojenize etmek için iğneleri en az 15 kez bir insülin şırıngasının steril 27 gauge iğnesi ile geçirin. Ve elde edilen karışımın 100 mikrolitresini seyreltme başına 900 mikrolitre steril PBS'ye aktararak homojen seyreltmeleri hazırlayın. Doğal ampisilin dirençli P.aeruginosa suşu için seçmek için, plaka 10 lb agar üzerine seyreltme mikrolitre ampisilin ile takviye ve 37 santigrat derece gecede onları kuluçka.
Ertesi gün kolonilerin sayısını saymak. Koloni oluşturan birimlerin toplam sayısının ve enfekte embriyo başına koloni oluşturan birimlerin ortalama sayısının hesaplanmasına izin vermek için. P.aeruginosa enfeksiyonunun öldürücülüğünü değerlendirmek için enjekte edilen embriyolar, ölü beyaz opak embriyoların sayısını sayarak bir stereo mikroskop altında enfeksiyon sonrası 20 saat olarak değerlendirilir.
Sonra yarım maksimal öldürücü konsantrasyon hesaplamak 50 p.aeruginosa doz 20 saat sonra enjekte embriyoların% 50 ölümü ile sonuçlanan.. Kistik fibrozis fenotipini doğrulamak için kalp karaciğeri ve pankreas gibi iç organların bozulmuş pozisyonu değerlendirilebilir. P.Aeruginosa ile enfekte kistik fibrozis embriyolarında faj tedavisi ile bakteriyel yük azalır.
48 saat sonrası döllenme sonrası gfp pozitif P.Aeroginosa bakterisi ile enfekte olan kistik fibrozis embriyoları embriyo dozu başına 30 koloni oluşturan üniteler 20 saat post-enfeksiyonda %50 ölümcül olduğunu göstermektedir. Faj tedavisi bakteriyel enjeksiyondan 30 dakika veya yedi saat sonra teslim edildiğinde enfeksiyon sonrası 20 saat eşit derecede etkilidir. Burada, bir kistik fibrozis ve GFP pozitif P.Aeruginosa enjekte embriyo dört, dokuz, 14 ve 18 saat post-enfeksiyon gösterilmiştir.
Buna karşılık kistik fibrozis artı P.Aeruginosa artı faj enjekte embriyo bakteri karşı faj eylem nedeniyle azaltılmış floresan gösterir. Kistik fibrozis embriyolarında P.aeruginosa enfeksiyonu ile oluşturulan inflamatuar yanıt, p.aeruginosa enjeksiyonu sonrası pro-inflamatuar sitokinler, TNF alfa ve interlökin 1 beta ekspresyonu ile ortaya çıktıkça, enjekte edilen zebra balığının kontrolüne göre anlamlı olarak artmaktadır. Ancak her iki inflamatuar sitokinin ekspresyonu faj kokteyli ortak enjekte edilen hayvanlarda azalır.
Fajlar dikkatle hazırlık sırasında tutulabilir herhangi bir kirletici endotoksin kaldırmak için arındırılmış olmalıdır. Faj preparatları virion morfolojisini değerlendirmek için elektron mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu psödomonas aeruginosa dışında bakteriler tarafından insan hastalarda enfeksiyon kistik fibrozis zebrabalığı modelinde faj tedavisi ile tedavi edilebilir olup olmadığını test etmek ilginç olurdu.
