هذا البروتوكول يسهل إعداد وإدارة كوكتيل الفيروسية والفاغ ضد pseudomonas aeruginosa في أجنة حمار وحشي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح في تقييم في الجسم الحي من فعالية phage في مواجهة العدوى البكتيرية. كوكتيل phage فعال في كل من نوع البرية والتليف الكيسي نماذج حمار وحشي.
فتح إمكانية تطبيق العلاج phage للعدوى البكتيرية في مرضى التليف الكيسي. ويمكن أيضا أن يتم تطبيق العلاج phage لمواجهة التهابات بكتيرية محددة في أنظمة نموذج أخرى. لإعداد مخزون phage للتجربة.
إضافة 1.25 مرات 10 إلى phages السابع إلى OD 600 من 0.05 P.aeruginosa الثقافة إلى تعدد العدوى من 10 مرات إلى الثلاثة السلبية واحتضان الثقافة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات مع اهتزاز حتى OD 600 قطرات إلى 0.1 إلى 0.3. في نهاية الحضانة احتضان lysate مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من DNAse وRNAse لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. وبليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
في نهاية الطرد المركزي تصفية عظمى من خلال 0.8 ميكرو متر المسام القطر وإضافة 58 غراما لكل لتر من كلوريد الصوديوم و 105 غرام لكل لتر من PEG 6000. احتضان الحل في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، عجلت phage عن طريق الطرد المركزي.
في نهاية مركزية إزالة عظمى وحل بعناية بيليه في 15 ملليلتر من مثلثات كلوريد الصوديوم العازلة. لتنقية phages بواسطة تدرج كثافة كلوريد سيسيوم ، أول طبقات ملليلتر من أربعة حلول مختلفة لكلوريد السيزيوم في أنابيب متعددة الألوان فائقة التروستر لـ SW 41 Rotor وإضافة 3.5 ملليلتر من تعليق الففاج إلى كل أنبوب. كلوريد سيزيوم سام.
دائماً اعتماد إجراءات السلامة المناسبة عند التعامل مع والتخلص من هذا المركب. عندما تم تحميل جميع الأنابيب، ضع الأنابيب في الدوار مع الحرص على أن تكون متوازنة الأنابيب. وطرد مركزي العينات لمدة ساعتين في 100،000 مرة ز وأربع درجات مئوية.
في نهاية الطرد المركزي، استخدم حقنة مع إبرة قياس 19 لpirate الطبقة البيضاء بين D يساوي 1.5 وD يساوي مناطق الكثافة 1.4. ونقل التعليقات إلى أنابيب بوليالومر جديدة SW 60 حجم. الطرد المركزي تعليق لمدة 16 ساعة على الأقل في 150، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية.
ونقل الأربطة المرئية إلى أنابيب غسيل الكلى مع قطع 6000 دالتون. ثم dialyze العينات التي تم جمعها مرتين ضد 500 ملليلتر من الماء لمدة 20 دقيقة لكل غسيل الكلى وبين عشية وضحاها ضد 500 ملليلتر من حاجز كلوريد الصوديوم تريس. في صباح اليوم التالي، قم بتصفية مخزون الفراج الناتج مع فلتر المسام 0.22 ميكرو متر وتخزين المخزون عند أربع درجات مئوية.
في يوم الحقن الدقيقة تمييع اثنين من حلول الأسهم مورفولينوس ميكرومولار واحد في المياه المعقمة إلى تركيز نهائي من 0.25 picomolar لكل جنين للحصول على محلول حقن morpholino morpholino microliter خمسة. وإضافة 0.5 ميكرولترات من الفينول الأحمر إلى كل حل. المقبل استخدام 20 ميكروليتر micropipette مع تلميح تحميل هلام غرامة لتحميل إبرة حقنة صغيرة مع حجم كامل من حل مختلط morpholino وتأمين الإبرة إلى المتلاعب الصغرى متصلة بالوقوف تحت مجهر ستيريو.
ثم مع واحد أو اثنين من الخلايا، أجنة أسماك الحمار الوحشي مرتبة على شريحة زجاجية وضعت داخل طبق بيتري قطرها 96 ملليمتر، واخترق المشيم وصفار مع طرف إبرة الحقن الدقيقة وحقن اثنين من nanoliters من خليط مورفيلينو في الجنين. في 26 ساعة بعد الإخصاب، تحميل إبرة الحقن الدقيقة مع ما يقرب من خمسة ميكرولترات من inoculum P.aeruginosa وإدراج الإبرة dorsally إلى نقطة البداية من قناة كوفييه التي يبدأ القناة تنتشر على كيس صفار. حقن واحد إلى ثلاثة نانولترات من inoculum PAO1 في الجنين مع التأكد من أن حجم يتوسع مباشرة داخل القناة ويدخل في الدورة الدموية.
بعد الحقن نقل الجنين في واحدة من اثنين من الأطباق بيتري الجديدة التي تحتوي على E3 المتوسطة الطازجة تستكمل مع فينيلthiourea لمدة 30 دقيقة أو ثلاث ساعات الحضانة في 28 درجة مئوية. المقبل، تحميل إبرة الحقن الدقيقة مع ما يقرب من خمسة ميكرولترات من كوكتيل phage وإصلاح الإبرة إلى حاقن الصغرى. ثم حقن واحد إلى ثلاثة نانولترات من كوكتيل phage في قناة كوفييه من كل جنين حقنت سابقا مع البكتيريا ووضع الأجنة في واحد من اثنين من الأطباق بيتري جديدة تحتوي على E3 المتوسطة الطازجة تستكمل مع فينيلthiourea في 28 درجة مئوية.
في أربع ساعات بعد العدوى، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل جنين مُغدّر إلى طبق زجاجي أسفل. وملء الطبق مع نقطة ذوبان منخفضة دافئة حل agarose. عندما يكون agarose باردًا ، املأ الطبق بلطف مع E3 المتوسط المكمل بمحلول التخدير.
ضع الطبق تحت المجهر الاستريو واستخدم طرف ماصة لوضع الجنين في الاتجاه المطلوب. ثم ضع الطبق تحت مجهر استريو فلوري مع فلتر فلوري للبكتيريا الإيجابية GFP لمدة تصل إلى 18 ساعة بعد العدوى وصورة الجنين لتطور تعبير GFP في تسع و 14 و 18 ساعة بعد العدوى. لتحديد العبء البكتيري في ثماني ساعات بعد العدوى، نقل 15 جنين حقن دقيق تخدير إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر واستبدال محلول التخدير مع 300 ميكرولترات من 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
مرر الإبر عبر إبرة قياس 27 معقمة من حقنة الأنسولين 15 مرة على الأقل لتجانس الأجنة. وإعداد التخفيفات التسلسلية من التجانس عن طريق نقل 100 ميكرولترات من الخليط الناتج إلى 900 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة في التخفيف. لتحديد لضغط P.aeruginosa مقاومة الأمبيسيلين الطبيعي، لوحة 10 ميكرولترات من التخفيفات على LB agar تكمل مع الأمبيسيلين واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي عد عدد المستعمرات. للسماح بحساب العدد الإجمالي لوحدات تشكيل المستعمرة ومتوسط عدد وحدات تشكيل المستعمرة لكل جنين مصاب. لتقييم فتك العدوى P.aeruginosa درجة الأجنة المحقونة في 20 ساعة بعد العدوى تحت مجهر ستيريو عن طريق عد عدد الأجنة البيضاء المبهمة الميتة.
ثم حساب تركيز نصف أقصى القاتل 50 جرعة من P.aeruginosa التي أدت إلى وفاة 50٪ من الأجنة عن طريق الحقن في 20 ساعة بعد العدوى. للتحقق من صحة النمط الظاهري للتليف الكيسي يمكن تقييم الوضع الضعيف للأعضاء الداخلية مثل الكبد القلب والبنكرياس. يتم تقليل العبء البكتيري عن طريق العلاج phage في أجنة التليف الكيسي المصابة بـ P.Aeruginosa.
في 48 ساعة بعد الإخصاب الإخصاب الأجنة التليف الكيسي المصابة بالبكتيريا P.Aeroginosa إيجابية GFP 30 وحدات تشكيل مستعمرة لكل جرعة الجنين يدل على 50٪ فتكا في 20 ساعة بعد العدوى. العلاج phage فعالة على قدم المساواة في 20 ساعة بعد العدوى عند تسليمها 30 دقيقة أو سبع ساعات بعد الحقن البكتيري. هنا، يظهر التليف الكيسي وPFP إيجابية P.Aeruginosa الجنين في أربع وتسعة و14 و 18 ساعة بعد العدوى.
وعلى النقيض من ذلك فإن التليف الكيسي بالإضافة إلى P.Aeruginosa زائد phage حقن الجنين يوضح انخفاض الفلوريس بسبب العمل phage ضد البكتيريا. الاستجابة الالتهابية التي تولدها العدوى P.aeruginosa في الأجنة التليف الكيسي هو زيادة كبيرة كما كشفت عن التعبير عن السيتوكينات الموالية للالتهابات, TNF ألفا وinterleukin 1 بيتا بعد حقن P.aeruginosa مقارنة بالسيطرة حقن حمار وحشي. يتم تقليل التعبير عن السيتوكينات الالتهابية في الحيوانات شارك في حقن كوكتيل phage.
يجب تنقية phages بعناية لإزالة أي إندوكسيوم الملوثة التي يمكن الاحتفاظ بها أثناء التحضير. يمكن تحليل الاستعدادات phage بواسطة المجهر الإلكتروني لتقييم مورفولوجيا فيفيرون. سيكون من المثير للاهتمام لاختبار ما إذا كان يمكن الشفاء من العدوى في المرضى البشريين من قبل بكتيريا أخرى من pseudomonas aeruginosa مع العلاج phage في نموذج حمار وحشي التليف الكيسي.
