描述治疗药物及其载体的运输特性对于确保有效的生物反应至关重要。这些方法有助于设计具有最佳充电功能的药物载体，以定位带负充电的组织。这些技术的主要优点是，它们能够通过一系列体外实验更好地预测体内的疗效，这些实验通过组织来描述溶质运输。
软骨疾病，如骨关节炎，仍然未经治疗，因为药物无法穿透密集的血管软骨基质，需要药物载体来序曲疗效。首先使用精细的任务擦拭，轻轻地去除表面的三毫米直径，一毫米厚软骨外植多余的PBS。使用平衡快速记录每个外植的湿重，并立即将外植放入 PBS 浴池以防止脱水。
接下来，在每口孔的96孔板内井中加入300微升新鲜准备的30微摩尔荧光标记阳离子肽载体溶液，并使用铲子在每口溶液中添加一个外植剂。用 300 微升 PBS 填充每个周围油井，并盖上板盖。用柔性薄膜密封板的边缘，以尽量减少蒸发，并将板在37摄氏度的培养箱中，以每分钟50转的速度将板放在摇床上24小时，轨道为15毫米。
在孵育结束时，将平衡浴液从每一井转移到单独的聚丙烯管中，然后从库存30微摩尔阳离子肽载体溶液中进行连续稀释，以产生标准曲线。然后，将每种溶液和标准200微升转移到黑色96孔板的单个孔中，并基于荧光标签的激发和发射波长获得每个样品和标准的荧光读数。要确定软骨外植中阳离子肽载体渗透的深度，请使用手术刀将直径六毫米、一毫米厚的软骨外植切成两半，并使用蛋白酶抑制剂补充 PBS 来滋润由此产生的半圆盘片。
将环氧树脂涂抹在定制设计的一维运输室的井中心，并在井内固定一个半盘外植，外植的表层朝向井的上游。从井中去除多余的胶水，防止与软骨扩散表面积接触，并在外植两侧加入80微升蛋白酶抑制剂补充PBS。将液体向上和向下移液，检查液体泄漏到另一侧。
如果没有泄漏，请用标有阳离子肽载体溶液的80微升30微摩尔荧光溶液取代上游端补充的蛋白酶抑制剂PBS，并小心地将运输室放入细胞培养皿中。用PBS覆盖菜底，避免阳离子肽载体溶液蒸发。注意上游和下游腔室的解决方案之间没有直接接触。
将覆盖的盘放在摇床上，在室温下限制颗粒沉积4或24小时，每分钟50转，轨道为15毫米。在孵育结束时，从腔室中去除外植，从每个外植中心切出约 100 微米厚的切片。将每片外植物放在玻璃滑梯和盖滑之间，用新鲜的蛋白酶抑制剂补充PBS来滋润切片。
将幻灯片固定到共合显微镜的舞台上，以 10 倍放大倍率通过切片的全厚获得一叠 Z-stack 荧光图像。打开图像文件和图像 J，单击"图像"，然后从下拉菜单中选择"堆栈"和"Z 项目"。然后，将切片编号从 1 输入到最终切片和"投影类型"下，选择平均强度并单击"确定"。
为了评估非平衡阳离子肽载体软骨扩散率，组装运输室的每一半，包括一个大型橡胶垫片、一个聚甲基丙烯酸酯刀片和一个小型橡胶垫片。测量软骨外植的厚度，然后将外植物放在塑料刀片的孔中，表面表面朝向上游腔室，将两半夹在一起完成组装。使用扳手将两半拧紧拧在一起，然后用两毫升蛋白酶抑制剂补充PBS填充上游腔室。
检查下游腔室有无来自上游腔室的泄漏。如果未检测到泄漏，则用两毫升蛋白酶抑制剂补充PBS填充下游腔室。在上流和腔室中添加一个迷你搅拌棒，并将腔室放在搅拌板上，使分光光度计的激光聚焦到下游腔室的中心。
在下游腔室后面分光光度计的信号接收器部分，收集稳定、实时的下游荧光发射读数至少五分钟。获得稳定读数后，在上游腔室中加入荧光标记阳离子肽载体库存溶液的预计算体积，最终浴液浓度为三微摩尔，并监测下游荧光信号，同时使溶质运输达到坡度的稳步增加。达到稳定状态后，将 20 微升溶液从上游腔室转移到下游腔室进行尖峰测试，并收集实时下游荧光读数。
过高的正电荷将限制溶质穿透到表面区域，因为载体与软骨基质的负电荷聚集群结合太强。相反，能够利用弱和可逆电荷相互作用的载体渗透到组织的深层区域。然而，具有最佳充电功能的药物载体不仅会穿透组织深处，而且会表现出高组织内吸收率，如所示，可以通过平衡浴和组织湿重的荧光测量确定。
非平衡扩散传输实验产生具有逐渐增加斜率的数据生成曲线。曲线的初始部分表示溶质基质结合相互作用时通过软骨的溶质扩散。一旦溶解物到达下游腔室，曲线的斜率会随着荧光读数随时间的增加而增加。
然后，曲线的第二部分达到一个稳定的斜率，表示稳定状态扩散。在曲线稳定状态部分绘制的切线 X 截距表示达到稳定状态扩散或 tau 滞后所用的时间。溶液从上游转移到下游腔室后，观察到荧光的峰值，此时可以使用稳定的荧光强度将荧光与浓度关联。
然后可以计算具有代表性的有效扩散率和稳定状态扩散值，如所示。请注意，由于所有基于电荷的绑定站点被占用，稳定状态扩散率比有效扩散率高两个数量级。因此，此时，扩散基于大小而不是电荷，导致相同大小的 CPC 之间的稳定状态扩散值相似。
在整个实验中保持外植水分并尽量减少溶液蒸发，以防止软骨形态和溶液浓度的变化，并确保准确和可重复的数据采集。在设计出具有最佳充电的药载体后，可以利用各种结合技术来改变药物，增强组织靶向，并促进评估其生物功效。
