我们通过一种称为外向发生、理解不实的生物学的过程来描述神经元聚集和细胞器挤出的体内机制，该过程可能与神经退行性疾病病理传播有关。这些方法对于实现挤出神经元外显体可重复评分是必要的，并演示了通过神经元转移到邻近细胞来分解细胞垃圾的机械解剖平台。定义神经元喷射聚集体的神经内机制实际上可能会影响新策略的设计，以帮助治疗人类神经退行性疾病。
对于基底条件，同生年龄的C.Elegans在20摄氏度的恒温下。要对细胞内动力学和外外发生特征进行实时成像，请将多达 20 种动物放在玻璃显微镜幻灯片上的 agaros 垫上，并固定动物。小心地将盖子滑过瘫痪的蠕虫，然后将幻灯片放在共和荧光显微镜的舞台上。
使用 10 到 40 倍的目标的 10 到 40 倍目标来识别 Brightfield 中所需的 Z 平面，记录蠕虫的定位、头部尾部方向和外阴位置，这些是以后神经元和外音识别的地标。保持在同一个 Z 平面上，切换到所选细胞合成器的宽场荧光观察 10 到 40 倍，并在 Z 轴内滚动，以观察动物的深度和焦点平面中的荧光表达。头部将有一个荧光神经环，更尖的尾巴将包含一到两个可见的后侧触摸神经元索马斯。
使用 63 倍镜头的放大率更高，有助于识别神经环、神经元过程和索玛身体。它首先有助于识别位于动物头部的神经环和横向神经元过程。为此，从蠕虫的头部开始，然后缓慢滚动 Z 轴，以识别连接神经元过程的神经环的平面。
一旦神经环被识别，在荧光视图中，沿着附加的神经元过程横向朝后向外阴，在那里索玛将明显。一旦圆形的索玛身体或身体聚焦，重要的是要识别附近的所有神经元。对于触摸神经元识别，首先找到ALML、ALMR和AVM soma，这应该是最亮的信号，并在过程结束时由圆形细胞体标记。
一旦找到最聚焦的神经元母体，使用AVM细胞，一个腹细胞，以帮助分配方向。如果 AVM 神经元与 ALM 位于同一平面上，则动物在其一侧休息，侧向神经元为 ALMR。如果 AVM 神经元与该问题 ALM 不在同一平面上，则最接近焦点平面的触摸神经元是 ALML 神经元。
也是有帮助的是识别PVM神经元，这是一个位于尾巴附近的腹体触摸神经元。PVM 的焦点平面将指示前触摸神经元是 ALML 还是 ALMR。如果所对ALM与PVM位于同一平面上，则观察到的接触神经元为ALML神经元。
在确定和分配了最聚焦的 ALM 之后，确定感兴趣区域附近和所有 Z 平面的其他索马实体的位置非常重要，以便不要将它们误认为是外向体。一旦感兴趣的触摸神经元被找到，ALMR或ALML，检查神经元大突出外层域，大到足以被视为芽外显子，这是至少五分之一的大小的原始索玛。如果没有观察到芽或外显域，进一步检查神经元母体，从索玛身体发出的附着薄丝。
附着的外层往往位于离原发索马更近的地方，并且位于类似的 Z 平面上。要识别一个未连接的外显子，寻找浓缩的排出荧光蛋白，这些蛋白通常比索马更亮。虽然在这里描述，有一个大的外层。
可能有多个荧光实体源自单个 soma。在不同的焦平面和从发现原始索玛的遥远横向区域寻找未连接的外向。外外层通常从神经元过程的后向向从索玛伸出。
检查未定位并标识为神经元索马斯的大型球形物体。虽然外层通常是物理结构，但随着时间的推移，它们可能会退化，形成更不规则的形状。搜索星空夜事件的存在以及多个外在事件的实例。
为了避免误认为和出平面的索马为外在，这是至关重要的识别所有附近的索马身体，甚至在观察开始时的对焦索马。可以观察到扩展或尖的 soma，但没有明确收缩站点的扩展不应作为外在器进行评分。拒绝在外向事件定量中未达到索玛大小的小已解析芽。
虽然成熟的中性可以随着年龄的增长而急剧延长，荧光蛋白可以迁移到这种结构的端端，但不要将神经素生长算作外显子。要识别非外流器的荧光实体，请务必排除任何自荧光，这些自荧光可能被误认为是宽场荧光下的星夜车碎片。要排除胚胎荧光信号，请在荧光和亮场照明之间切换，并检查信号与子宫内的卵子是否关联。
此表提供了用于监测外层生产的不同触摸神经元表示荧光报告器的摘要。已知在外层中挤出的货物包括聚合物，如Q128、人类亨廷顿扩张性多糖胺重复的融合、用利索体相关膜蛋白标记的LysosomeGP，以及标有基质局部GP的线粒体。细胞质GP不会强烈排出，并优先保留在索马，虽然GP可以用来弱可视化外显子。
一般来说，ALMR神经元表达mCherry在基础条件下的外向生产开始于成年的第一天，在成人第一天至第三天的主要外外层生产时间范围内检查的ALMR的范围从5%到25%不等。特殊的应力和遗传扰动可以大大增加ALMR神经元内的外外层产生。在检查感兴趣的神经元和周围区域的外外层域、完整的外显子或星空夜事件之前，找到所有附近的神经元至关重要。
当您熟悉手动识别外外层时，可以使用增强的吞吐量方法使用高含量成像进行大规模筛查，从而允许进行全基因组分析和机械外外发生解剖。
