Caracterizamos los mecanismos in vivo de extrusión de áridos y orgánulos de las neuronas a través de un proceso llamado exofergénesis, biología mal entendida que probablemente sea relevante para la propagación de la patología de la enfermedad neurodegenerativa. Estos enfoques son necesarios para lograr la puntuación reproducible de los exophers neuronales extruidos y demuestran una plataforma para la disección mecanicista de la eliminación de basura celular a través de la transferencia neuronal a las células vecinas. Definir los mecanismos in vivo de cómo las neuronas expulsan los agregados puede influir realmente en el diseño de nuevas estrategias para ayudar en el tratamiento de las condiciones neurodegenerativas humanas.
Para condiciones basales, casa C.Elegans de la misma edad biológica a una temperatura constante de 20 grados Celsius. Para obtener imágenes en vivo de la dinámica intracelular y las características de la exofergénesis, coloque hasta 20 animales en una almohadilla de agaros en un portaobjetos de vidrio e inmovilice a los animales. Coloque cuidadosamente un resbalón de cubierta sobre los gusanos paralizantes y coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio de fluorescencia confocal.
Utilice un objetivo de 10 a 40x para identificar el plano Z deseado en Brightfield, tomando notas del posicionamiento del gusano, la orientación de la cola de la cabeza y la ubicación de la vulva, que son puntos de referencia para la identificación neuronal y de exoféro posterior. Permaneciendo en el mismo plano Z, cambie a la visualización de fluorescencia de campo ancho a 10 a 40x para el reportero citosólico elegido, y desplácese dentro del eje Z para observar la profundidad del animal y la expresión de fluorescencia en el plano focal. La cabeza tendrá un anillo nervioso fluorescente, y la cola más puntiaguda contendrá de uno a dos somas de neuronas táctiles laterales posteriores visibles.
Un aumento más alto con una lente 63x puede ayudar a identificar el anillo nervioso, los procesos neuronales y los cuerpos de soma. Primero es útil identificar el anillo nervioso ubicado en la cabeza de los procesos neuronales animales y laterales. Para ello, comience en la cabeza del gusano y desplácese lentamente a través del eje Z para identificar el plano del anillo nervioso donde se unen los procesos neuronales.
Una vez identificado el anillo nervioso, en la vista de fluorescencia seguir el proceso neuronal adjunto lateralmente en la dirección posterior hacia la vulva, donde el soma será evidente. Una vez que el cuerpo o cuerpos de soma redondos están enfocados, es importante identificar todas las neuronas cercanas. Para la identificación de neuronas táctiles, primero encuentre el SOma ALML, ALMR y AVM, que deben ser las señales más brillantes y marcados por un cuerpo celular redondo al final del proceso.
Una vez localizado el soma neuronal más enfocado, utilice la célula AVM, una célula ventral, para ayudar a asignar la orientación. Si la neurona de la malformación arteriovenosa está en el mismo plano que la ALM, entonces el animal está descansando en su lado y la neurona lateral es el ALMR. Si la neurona de la malformación arteriovenosa no está en el mismo plano que la ALM en cuestión, la neurona táctil más cercana al plano focal es la neurona ALML.
También es útil para identificar la neurona PVM, que es una neurona táctil ventral situada cerca de la cola. El plano de enfoque del PVM indicará si la neurona táctil anterior es la ALML o ALMR. Si el ALM en cuestión está en el mismo plano que el PVM, entonces la neurona táctil observada es la neurona ALML.
Después de que el ALM más enfocado ha sido identificado y asignado, es importante determinar las posiciones de los otros cuerpos de soma cerca del área de interés y en todos los planos Z, para no confundirlos con los exophers. Una vez que se ha localizado la neurona táctil de interés, el ALMR o ALML, inspeccionar la neurona en busca de grandes dominios de exofero salientes, lo suficientemente grandes como para ser considerado un exofero de cogollos, que es al menos una quinta parte del tamaño del soma de origen. Si no se observa ningún dominio de brote o exoférico, inspeccione aún más el soma neuronal en busca de un filamento delgado unido que emana del cuerpo del soma.
Los exoferos adjuntos tienden a estar situados más cerca del soma de origen y en un plano Z similar. Para identificar un exofero no conectado, busca proteínas fluorescentes expulsadas concentradas, que a menudo son más brillantes que el soma. Aunque se representa aquí, hay un gran exofero.
Puede haber más de una entidad fluorescente originaria de un solo soma. Busque exophers no conectados en diferentes planos focales y en la región lateral distante desde donde se encontró el soma de origen. Los exoferes típicamente sobresalen del soma en una dirección posterior del proceso neuronal.
Compruebe si hay objetos esféricos grandes que no estén posicionados e identificados como somas neuronales. Aunque los exoferos son típicamente estructuras esfíricas, pueden degradarse con el tiempo, adquiriendo una forma más irregular. Busca la presencia de eventos nocturnos estrellados y casos de múltiples eventos de exofer.
Para evitar confundir y soma fuera de plano para un exofero, es fundamental identificar todos los cuerpos de soma cercanos, incluso somas fuera de foco al comienzo de la observación. Se puede observar un soma extendido o puntiagudo, pero una extensión sin un sitio de constricción clara no debe ser puntuada como un exofero. Rechaza pequeños cogollos resueltos que no alcancen una quinta parte del tamaño del soma en la cuantificación de eventos de exofer.
Aunque las neuritas maduras pueden extenderse dramáticamente con la edad, y las proteínas fluorescentes pueden migrar hacia el extremo distal de dichas estructuras, no cuenten los crecimientos de neurita como exoferos. Para identificar entidades fluorescentes que no son exoferas, asegúrese de excluir cualquier autofluorescencia, que puede confundirse con desechos vesiculares nocturnos estrellados bajo fluorescencia de campo ancho. Para excluir las señales fluorescentes embrionarias, cambie entre la fluorescencia y la iluminación de campo brillante, y compruebe la asociación de la señal con los huevos dentro del útero.
Esta tabla proporciona un resumen de diferentes reporteros fluorescentes expresados en neuronas táctiles que se han utilizado para monitorear la producción de exoféros. Las cargas que se sabe que se extruyen en los exoferores incluyen agregados como Q128, una fusión de repeticiones de poliglutamina expandida de Huntington humano, lisosomas GFP etiquetados con proteína de membrana asociada al lisosomal, y mitocondrias etiquetadas con GFP localizado en matriz. La GFP citoplasma no se expulsa enérgicamente y se retiene preferentemente en el soma, aunque la GFP se puede utilizar para visualizar débilmente los exoferos.
En general, la producción de exoféricos por el mCherry que expresa la neurona ALMR en condiciones basales comienza en el primer día de la edad adulta y oscila entre aproximadamente el cinco y el 25% de los ALMR examinados dentro del período de tiempo de producción de exoferes principales del día adulto uno al tres. Las tensiones particulares y las perturbaciones genéticas pueden aumentar en gran medida la producción de exoferas dentro de las neuronas ALMR. Es crucial localizar todas las neuronas cercanas antes de inspeccionar la neurona de interés y el área circundante para los dominios de exoféro, los exophers intactos o los eventos nocturnos estrellados.
Cuando se sienta cómodo con la identificación manual de los exopheros, se pueden emplear métodos de rendimiento mejorados para el cribado a gran escala mediante imágenes de alto contenido, lo que permite el análisis del genoma completo y la disección de exofergénesis mecánica.
