Nörodejeneratif hastalık patolojisi yayılımı ile ilgili olarak, eksogenez, kötü anlaşılmış biyoloji adı verilen bir süreçle nöronlardan agrega ve organel ekstrüzyonun in vivo mekanizmalarını karakterize ediyoruz. Bu yaklaşımlar ekstrüzyon nöronal eksophers tekrarlanabilir puanlama elde etmek için gerekli ve komşu hücrelere nöronal transfer yoluyla hücresel çöp eliminasyonu mekanistik diseksiyon için bir platform göstermek. Nöronların agregaları nasıl çıkardığının in vivo mekanizmalarının tanımlanması, insan nörodejeneratif koşullarının tedavisinde yardımcı olmak için yeni stratejilerin tasarımını etkileyebilir.
Bazal koşullar için, 20 santigrat derece sabit sıcaklıkta aynı biyolojik yaşta ev C.Elegans. Hücre içi dinamiklerin ve ekofhergenezin özelliklerinin canlı görüntülenmesi için, 20 kadar hayvanı cam mikroskop kaydırağında bir agaros pedine yerleştirin ve hayvanları hareketsiz hale getirin. Dikkatle felç solucanlar üzerinde bir kapak kayma yerleştirin ve bir konfokal floresan mikroskop aşamasına slayt yerleştirin.
Brightfield istenilen Z düzlemi tanımlamak için 10-40x objektif kullanın, solucan konumlandırma notları alarak, baş kuyruk oryantasyonu, ve vulva konumu, hangi daha sonra nöronal ve exopher kimlik için dönüm noktası olan. Aynı Z düzleminde kalarak, seçilen sitosolik muhabir için 10 ila 40 x geniş alan floresan görüntülemeye geçin ve odak düzlemindeki hayvanın derinliğini ve floresan ifadesini gözlemlemek için Z ekseni içinde ilerleyin. Baş floresan sinir halkası olacak, ve daha sivri kuyruk bir ila iki görünür posterior lateral dokunmatik nöron somas içerecektir.
63x lens ile yüksek büyütme sinir halkası tanımlamak için yardımcı olabilir, nöronal süreçler, ve soma organları. İlk olarak hayvan ve lateral nöronal süreçlerin başında bulunan sinir halkası tanımlamak için yararlıdır. Bunu yapmak için, solucanın başında nöral süreçlerin bağlı olduğu sinir halkasının düzlemini belirlemek için yavaşça Z ekseninde ilerleyin.
Bir kez sinir halkası tespit edilmiştir, floresan görünümünde vulva doğru arka yönde yanal bağlı nöronal süreci izleyin, soma belirgin olacak nerede. Yuvarlak soma vücut veya organları odak olduğunda, yakındaki tüm nöronlar belirlemek önemlidir. Dokunmatik nöron tanımlama için, ilk ALML bulmak, ALMR, ve AVM soma, hangi parlak sinyalleri olmalıdır ve sürecin sonunda yuvarlak bir hücre gövdesi ile işaretlenmiş.
Bir kez en odak nöronal soma yer olmuştur, AVM hücre kullanın, bir ventral hücre, oryantasyon atamaya yardımcı olmak için. AVM nöron ALM ile aynı düzlemde ise, o zaman hayvan yan ve lateral nöron ALMR dinleniyor. AVM nöron söz konusu ALM ile aynı düzlemde değilse, odak düzlemine en yakın dokunmatik nöron ALML nörondur.
Ayrıca yararlı PVM nöron tanımlamak için, kuyruk yakınında bulunan bir ventral dokunma nöron olan. PVM odak düzlemi ön dokunmatik nöron ALML veya ALMR olup olmadığını gösterir. Söz konusu ALM PVM ile aynı düzlemde ise, o zaman gözlenen dokunmatik nöron ALML nöron.
En odak alm tespit edilip atandıktan sonra, ilgi alanı ve tüm Z uçakları nda yakın diğer soma organlarının konumlarını belirlemek önemlidir, exophers onları yanlış değil. İlgi touch nöron bulunduğunda, ALMR veya ALML, büyük çıkıntılı eksopher etki alanları için nöron incelemek, yeterince büyük bir tomurcuk eksopher olarak kabul edilecek, en az beşte biri kökenli soma boyutu. Hiçbir tomurcuk veya exopher etki gözlenirse, daha fazla soma vücuttan yayılan bağlı ince filaman için nöronal soma incelemek.
Ekli eksophers soma kökenli yakın ve benzer bir Z düzlemde yer olma eğilimindedir. Bir bekar exopher tanımlamak için, genellikle soma daha parlak konsantre süzme floresan proteinler arayın. Burada tasvir edilmesine rağmen, büyük bir eksopher vardır.
Tek bir soma dan kaynaklanan birden fazla floresan varlık olabilir. Farklı odak düzlemlerinde ve soma kaynaklı bulunan uzak lateral bölgede bekar eksophers arayın. Eksophers genellikle nöronal süreçten bir posterior yönde soma uzak çıkıntı.
Nöronal somas olarak tanımlanan ve konumlandırılmayan büyük küresel nesneleri kontrol edin. Ekoferler genellikle boğucu yapılar olmasına rağmen, zaman içinde bozulabilir, daha düzensiz bir şekil elde. Yıldızlı gece olaylarının varlığını ve birden çok eksopher olayının örneğini arayın.
Bir eksopher için yanlış ve düzlem dışı soma önlemek için, gözlem başında bile odak dışı somas, tüm yakın soma organları tanımlamak için önemlidir. Genişletilmiş veya sivri soma görülebilir, ancak net bir daralma yeri olmayan bir uzatma eksopher olarak puanlandırılmamalıdır. Exopher olay nicelleştirmede soma boyutunun beşte birine ulaşamayan küçük çözülmüş tomurcukları reddedin.
Olgun nöritler yaşla birlikte önemli ölçüde uzatabilse ler ve floresan proteinler bu tür yapıların distal ucuna göç etseler de, dışa dönük çıkıntıları dışa dönük olarak saymaz. Ekophers olmayan floresan varlıkları tanımlamak için, geniş alan floresan altında yıldızlı gece vesiküler enkaz için yanlış olabilir herhangi bir otofloresan, dışlamak için emin olun. Embriyonik floresan sinyalleri dışlamak için, floresan ve brightfield aydınlatma arasında geçiş, ve rahim içinde yumurta ile sinyal ilişkilendirme kontrol edin.
Bu tablo, eksopher üretimini izlemek için kullanılan farklı dokunma nöron ifade floresan muhabirlerin bir özetini sağlar. Ekzoteklerde ekstrüzyon yaptığı bilinen yükler arasında Q128, insan Huntington genişletilmiş poliglutamin tekrarlarının bir füzyonu, lysozomal ilişkili membran proteini ile etiketlenmiş lyozomlar GFP ve matris lokalize GFP ile etiketlenmiş mitokondri gibi agregalar bulunmaktadır. Sitoplazmik GFP güçlü bir şekilde sınır dışı edilmez ve tercihen soma'da tutulur, ancak GFP dışa dönükleri zayıf bir şekilde görselleştirmek için kullanılabilir.
Genel olarak, bazal koşullar altında ALMR nöron ifade mCherry tarafından eksopher üretimi yetişkinliğin ilk gününde başlar ve yetişkin gün bir ila üç ana ekopher üretim zaman dilimi içinde incelenen ALMR yaklaşık% beş ila % 25 arasında değişmektedir. Özellikle gerilmeler ve genetik tedirginlikler ALMR nöronlar içinde eksopher üretimini büyük ölçüde artırabilir. Bu dışa etki alanları, bozulmamış eksophers, ya da yıldızlı gece olayları için ilgi ve çevredeki nöron incelemeden önce yakındaki tüm nöronlar bulmak için çok önemlidir.
Ekopherleri manuel olarak tanımlamakta rahat olduğunuzda, yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak büyük ölçekli tarama için geliştirilmiş iş verme yöntemleri kullanılabilir, böylece tüm genom analizi ve mekanistik ekophergenez diseksiyonu kullanılabilir.
