Caratterizziamo i meccanismi in vivo dell'estrusione aggregata e organelle dai neuroni attraverso un processo chiamato esofergenesi, biologia poco compresa che è probabilmente rilevante per la diffusione della patologia della malattia neurodegenerativa. Questi approcci sono necessari per ottenere un punteggio riproducibile di esoferi neuronali estrusi e dimostrare una piattaforma per la dissezione meccanicistica dell'eliminazione della spazzatura cellulare attraverso il trasferimento neuronale alle cellule vicine. Definire i meccanismi in vivo di come i neuroni espelleno gli aggregati può effettivamente influenzare la progettazione di nuove strategie per aiutare nel trattamento delle condizioni neurodegenerative umane.
Per le condizioni basali, casa C.Elegans della stessa età biologica ad una temperatura costante di 20 gradi Celsius. Per l'imaging dal vivo della dinamica intracellulare e delle caratteristiche dell'esofergenesi, posizionare fino a 20 animali su un cuscinetto di agaros su uno scivolo al microscopio di vetro e immobilizzare gli animali. Posizionare con cura un coperchio scivolare sui vermi paralizzati e posizionare lo scivolo sullo stadio di un microscopio a fluorescenza confocale.
Usa un obiettivo da 10 a 40x per identificare il piano Z desiderato a Brightfield, prendendo nota del posizionamento del verme, dell'orientamento della coda della testa e della posizione della vulva, che sono punti di riferimento per l'identificazione neuronale ed esofera successiva. Rimanendo nello stesso piano Z, passare alla visione a fluorescenza a campo largo a 10-40x per il reporter citosolico scelto e scorrere all'interno dell'asse Z per osservare la profondità dell'animale e l'espressione di fluorescenza nel piano focale. La testa avrà un anello nervoso fluorescente e la coda più appuntita conterrà da uno a due somas neuronali laterali posteriori visibili.
Un ingrandimento più elevato con una lente 63x può aiutare a identificare l'anello nervoso, i processi neuronali e i corpi soma. È prima utile identificare l'anello nervoso situato nella testa dei processi neuronali animali e laterale. Per fare ciò, inizia dalla testa del verme e scorri lentamente attraverso l'asse Z per identificare il piano dell'anello nervoso in cui sono attaccati i processi neuronali.
Una volta identificato l'anello nervoso, nella vista a fluorescenza seguire lateralmente il processo neuronale collegato nella direzione posteriore verso la vulva, dove il soma sarà evidente. Una volta che il corpo o i corpi rotondi del soma sono a fuoco, è importante identificare tutti i neuroni nelle vicinanze. Per l'identificazione dei neuroni tattile, trova prima il soma ALML, ALMR e AVM, che dovrebbe essere il segnale più luminoso e contrassegnato da un corpo cellulare rotondo alla fine del processo.
Una volta individuato il soma neuronale più a fuoco, utilizzare la cellula AVM, una cellula ventrale, per aiutare ad assegnare l'orientamento. Se il neurone AVM si trova nello stesso piano dell'ALM, allora l'animale sta riposando su un lato e il neurone laterale è l'ALMR. Se il neurone AVM non si trova nello stesso piano dell'ALM in questione, il neurone tattile più vicino al piano focale è il neurone ALML.
Utile è anche identificare il neurone PVM, che è un neurone tattile ventrale situato vicino alla coda. Il piano di messa a fuoco della PVM indicherà se il neurone tattile anteriore è l'ALML o l'ALMR. Se l'ALM in questione si trova nello stesso piano della PVM, allora il neurone touch osservato è il neurone ALML.
Dopo che l'ALM più a fuoco è stato identificato e assegnato, è importante determinare le posizioni degli altri corpi soma vicino all'area di interesse e in tutti i piani Z, in modo da non scambiarli per esoferi. Una volta localizzato il neurone tattile di interesse, l'ALMR o l'ALML, ispezionano il neurone alla ricerca di grandi domini esoferici sporgenti, abbastanza grandi da essere considerati un esofero di gemme, che è almeno un quinto delle dimensioni del soma originario. Se non si osserva alcun germoglio o dominio esofero, ispezionare ulteriormente il soma neuronale alla ricerca di un filamento sottile attaccato che emana dal corpo soma.
Gli esoferi attaccati tendono ad essere situati più vicino al soma originario e in un piano Z simile. Per identificare un esofero non attaccato, cercare proteine fluorescenti espulse concentrate, che sono spesso più luminose del soma. Sebbene raffigurato qui, c'è un grande esofero.
Ci possono essere più di un'entità fluorescente originata da un singolo soma. Cerca esoferi non attaccati in diversi piani focali e nella lontana regione laterale da cui è stato trovato il soma originario. Gli esoferi tipicamente sporgono lontano dal soma in direzione posteriore dal processo neuronale.
Verificare la presenza di oggetti sferici di grandi dimensioni che non sono posizionati e identificati come soma neuronali. Sebbene gli esoferi siano tipicamente strutture sfioriche, possono degradarsi nel tempo, acquisendo una forma più irregolare. Cerca la presenza di eventi notturni stellati e istanze di più eventi di esopher.
Per evitare confusione e soma fuori piano per un esofero, è fondamentale identificare tutti i corpi soma vicini, anche i soma fuori fuoco all'inizio dell'osservazione. Si può osservare un soma esteso o appuntito, ma un'estensione senza un chiaro sito di costrizione non dovrebbe essere segnata come esofero. Rifiuta piccoli gemme risolte che non raggiungono un quinto delle dimensioni del soma nella quantificazione degli eventi di esoferrazione.
Sebbene i neuriti maturi possano estendersi drammaticamente con l'età, e le proteine fluorescenti possano migrare nell'estremità distale di tali strutture, non contano le escrescenze di neurite come esoferi. Per identificare entità fluorescenti che non sono esoferi, assicurarsi di escludere qualsiasi autofluorescenza, che può essere scambiata per detriti vescicolari notturni stellati sotto fluorescenza a campo largo. Per escludere i segnali fluorescenti embrionali, passare dalla fluorescenza all'illuminazione a campo luminoso e verificare l'associazione del segnale con le uova all'interno dell'utero.
Questa tabella fornisce un riepilogo dei diversi reporter fluorescenti espressi dai neuroni tattilo che sono stati utilizzati per monitorare la produzione di esofero. I carichi che sono noti per essere estrusi negli esoferi includono aggregati come Q128, una fusione di ripetizioni di poliglutamina espansa huntington umana, lisosomi GFP taggati con proteina membrana associata lisosomiale e mitocondri taggati con GFP localizzata a matrice. La GFP citoplasmatica non è fortemente espulsa, ed è mantenuta preferenzialmente nel soma, anche se la GFP può essere usata per visualizzare debolmente gli esoferi.
In generale, la produzione di esoferici da parte della mCherry che esprime neuroni ALMR in condizioni basali inizia il primo giorno di età adulta e varia da circa il cinque al 25% degli ALMR esaminati entro il periodo di produzione principale di esoferico del primo giorno adulto a tre. Particolari stress e perturbazioni genetiche possono aumentare notevolmente la produzione di esoferici all'interno dei neuroni ALMR. È fondamentale localizzare tutti i neuroni vicini prima di ispezionare il neurone di interesse e l'area circostante alla ricerca di domini esoferici, esoferi intatti o eventi notturni stellati.
Quando ti senti a tuo agio nell'identificare manualmente gli esoferi, è possibile utilizzare metodi di produttività avanzati per lo screening su larga scala utilizzando l'imaging ad alto contenuto, consentendo l'analisi dell'intero genoma e la dissezione dell'esofergenesi meccanicistica.
