Nous caractérisons les mécanismes in vivo de l’extrusion globale et organelle des neurones par l’intermédiaire d’un processus appelé exophergenèse, biologie mal comprise qui est probablement pertinente à la pathologie neurodégénérative de la maladie se propager. Ces approches sont nécessaires pour atteindre la notation reproductible des exophers neuronaux extrudés et démontrer une plate-forme pour la dissection mécaniste de l’élimination cellulaire de déchets par transfert neuronal aux cellules voisines. La définition des mécanismes in vivo de la façon dont les neurones éjectent les agrégats peut effectivement influencer la conception de nouvelles stratégies pour aider au traitement des maladies neurodégénératives humaines.
Pour les conditions basales, abritez C.Elegans du même âge biologique à une température constante de 20 degrés Celsius. Pour l’imagerie vivante de la dynamique intracellulaire et des caractéristiques de l’exophergenèse, placez jusqu’à 20 animaux sur un tampon d’agaros sur une lame de microscope en verre et immobilisez les animaux. Placez soigneusement un glissement de couverture sur les vers paralysés et placez la lame sur la scène d’un microscope à fluorescence confocal.
Utilisez un objectif de 10 à 40 x pour identifier le plan Z désiré à Brightfield, en prenant des notes sur le positionnement du ver, l’orientation de la queue de la tête et l’emplacement de la vulve, qui sont des repères pour l’identification neuronale et exophère ultérieure. En restant dans le même plan Z, passez à la visualisation de fluorescence à large champ à 10 à 40x pour le journaliste cytosolic choisi, et faites défiler dans l’axe Z pour observer la profondeur de l’animal et l’expression de fluorescence dans le plan focal. La tête aura un anneau nerveux fluorescent, et la queue plus pointue contiendra un à deux somas visibles de neurone latéral postérieur.
Grossissement plus élevé avec une lentille 63x peut aider à identifier l’anneau nerveux, les processus neuronaux, et les corps soma. Il est d’abord utile d’identifier l’anneau nerveux situé dans la tête de l’animal et les processus neuronaux lauraux. Pour ce faire, commencez à la tête du ver et faites défiler lentement l’axe Z pour identifier le plan de l’anneau nerveux où les processus neuronaux sont fixés.
Une fois que l’anneau nerveux a été identifié, dans la vue de fluorescence suivre le processus neuronal attaché latéralement dans la direction postérieure vers la vulve, où le soma sera apparent. Une fois que le corps ou le corps rond de soma sont au point, il est important d’identifier tous les neurones à proximité. Pour l’identification des neurones tactiles, trouvez d’abord l’ALML, l’ALMR et l’AVM soma, qui devraient être les signaux les plus brillants et marqués par un corps cellulaire rond à la fin du processus.
Une fois que le soma neuronal le plus au point a été localisé, utilisez la cellule AVM, une cellule ventrale, pour aider à assigner l’orientation. Si le neurone AVM est dans le même plan que l’ALM, alors l’animal se repose sur le côté et le neurone latéral est l’ALMR. Si le neurone AVM n’est pas dans le même plan que l’ALM en question, le neurone tactile le plus proche du plan focal est le neurone ALML.
Il est également utile d’identifier le neurone PVM, qui est un neurone tactile ventral situé près de la queue. Le plan de mise au point du PVM indiquera si le neurone tactile antérieur est l’ALML ou l’ALMR. Si l’ALM en question est dans le même plan que le PVM, alors le neurone tactile observé est le neurone ALML.
Une fois que l’ALM le plus au point a été identifié et assigné, il est important de déterminer les positions des autres organismes soma près de la zone d’intérêt et dans tous les plans Z, afin de ne pas les confondre avec des exophères. Une fois que le neurone tactile d’intérêt a été localisé, l’ALMR ou ALML, inspecter le neurone pour les grands domaines d’exopher saillants, assez grand pour être considéré comme un exopher bourgeon, qui est au moins un cinquième de la taille du soma d’origine. Si aucun domaine de bourgeon ou d’exopher n’est observé, inspectez davantage le soma neuronal pour un filament mince attaché émanant du corps de soma.
Les exophères attachés ont tendance à être situés plus près du soma d’origine et dans un plan Z similaire. Pour identifier un exopher inaccessible, recherchez les protéines fluorescentes expulsées concentrées, qui sont souvent plus brillantes que le soma. Bien que représenté ici, il ya un grand exopher.
Il peut y avoir plus d’une entité fluorescente provenant d’un seul soma. Recherchez des exophères non attachés dans différents plans focaux et dans la région latérale éloignée d’où le soma d’origine a été trouvé. Les exophères dépassent généralement loin du soma dans une direction postérieure du processus neuronal.
Vérifiez s’il y a de gros objets sphériques qui ne sont pas positionnés et identifiés comme des somas neuronaux. Bien que les exophères soient généralement des structures sphyriques, elles peuvent se dégrader au fil du temps, acquérant une forme plus irrégulière. Recherchez la présence d’événements nocturnes étoilés et, par exemple, de multiples événements exopher.
Pour éviter de confondre et de sortir de l’avion soma pour un exopher, il est essentiel d’identifier tous les corps de soma à proximité, même somas hors de discussion au début de l’observation. Un soma étendu ou pointu peut être observé, mais une extension sans un site clair de constriction ne doit pas être notée comme exopher. Rejeter les petits bourgeons résolus qui n’atteignent pas un cinquième de la taille du soma dans la quantification des événements exopher.
Bien que les neurites matures puissent s’étendre considérablement avec l’âge, et que les protéines fluorescentes puissent migrer vers l’extrémité distale de ces structures, ne comptez pas les excroissances neurite comme exophères. Pour identifier les entités fluorescentes qui ne sont pas des exophères, assurez-vous d’exclure toute autofluorescence, qui peut être confondue avec des débris vésiculaires nocturnes étoilés sous fluorescence à large champ. Pour exclure les signaux fluorescents embryonnaires, passez de la fluorescence à l’illumination des champs lumineux, et vérifiez l’association du signal avec les œufs dans l’utérus.
Ce tableau fournit un résumé des différents neurones tactiles exprimés journalistes fluorescents qui ont été utilisés pour surveiller la production d’exophères. Les cargaisons qui sont connues pour être extrudées chez les exophères comprennent des agrégats tels que Q128, une fusion de répétitions humaines de polyglutamine élargie huntington, lysosomes GFP marqués avec la protéine membranaire associée lysosomale, et mitochondries étiquetées avec GFP matrix-localisé. Le GFP cytoplasmique n’est pas fortement expulsé, et est préférentiellement maintenu dans le soma, bien que GFP puisse être employé pour visualiser faiblement des exophers.
En général, la production d’exopher par la mCherry exprimant les neurones ALMR dans des conditions basales commence le premier jour de l’âge adulte et varie d’environ cinq à 25% des ALMR examinés dans le délai principal de production d’exopher du jour adulte un à trois. Des contraintes particulières et des perturbations génétiques peuvent augmenter considérablement la production d’exopher dans les neurones ALMR. Il est crucial de localiser tous les neurones à proximité avant d’inspecter le neurone d’intérêt et les environs pour les domaines exophères, exophères intacts, ou des événements nocturnes étoilés.
Lorsque vous êtes à l’aise avec l’identification manuelle des exophères, des méthodes améliorées de débit pour le dépistage à grande échelle à l’aide de l’imagerie à haute teneur peuvent être utilisées, ce qui permet l’analyse du génome entier et la dissection de l’exophergenèse mécaniste.
