小鼠肾中微RNA表达与单体尿阻的定量实时PCR评价

这种方法使得在患有多种病理条件的小鼠肾脏中提供微RNA表达成为可能，例如肾纤维化。该技术的主要优点是，它通过使用一个简单的过程，节省时间，防止技术错误，使微RNA表达分析具有高精度和灵敏度。要进行假手术，请使用手术剪刀和钳子在腹部的皮肤进行切口，将肌肉和腹膜从膀胱切到肋骨的左下边缘。

用 PBS 润湿两个棉签，小心地将肠子拉到一边。放置湿润的拭子，以确定左肾和尿尿器。关闭膜膜，然后用4-0尼龙切口。

要执行单侧尿道阻塞，或UOU，在腹部的皮肤切口，并削减肌肉和腹膜，证明为假手术。将 2.5 毫升注射器放在鼠标下方。用 PBS 润湿两个棉签，然后用钳子小心地将肠子拉到一侧，然后放置棉签以识别左侧尿尿器。

用钳子抬起左肾。使用 4-0 丝绸将左尿尿器在两个相距约 1 厘米的地方进行开裂。切开两个粘结中心点的尿道，然后用4-0尼龙缝合线关闭膜和切口。

切开膜后，如前所述，用钳子抬起，并使用手术剪刀在上边缘做侧切，然后沿着肋骨的最低边缘继续切口。识别左肾，用PBS回流，直到肾脏变成黄白。用手术剪刀切割左肾动脉和静脉，将其取出，并放在培养皿中，然后用PBS小心洗涤。

用手术剪刀和钳子将肾脏切成大约10毫克的样品，将肾脏的每一块放入自己的1.5毫升微离心管中，并关闭管盖。在硅胶均质器中加入肾脏样品，并加入700微升苯基/瓜尼丁基解压试剂。慢慢地按压和扭转均质器对肾脏样本的纠缠，以均匀化它。

重复压榨和扭曲，直到样品完全溶解在解解试剂中。为了进一步使样品均质化，将均质裂酸转移到生物聚合物旋转柱上，并在14，000次G下旋转三分钟，然后将沉淀的裂酸转移到未使用的1.5毫升微离心管中。将管中的利沙酸盐与140微升氯仿混合，并紧贴管盖。

要混合酸盐和氯仿，反转管15次。在室温下孵育样品2至3分钟，然后在12，000次G下旋转，在4摄氏度下旋转15分钟。在不干扰沉淀物的情况下，将上流水液转移到新的1.5毫升微离心管中，并加入1.5倍的100%乙醇体积。

漩涡混合物五秒钟。将样品的 700 微升加载到两毫升收集管中的膜锚定旋转柱上。关闭柱盖，在 15，000 次 G 下旋转柱，15 秒，然后将沉淀的裂酸扔掉收集管中沉淀的裂物。

在两毫升收集管中，将 700 微升洗涤缓冲液添加到膜锚定旋转柱中，彻底清洗样品。然后重复离心并扔掉收集管。每次洗涤两次，用 500 微升的洗涤缓冲液重复洗涤。

上次洗涤后，在两毫升收集管中旋转膜锚旋转柱，在 15，000 次 G 下旋转一分钟，然后扔掉沉淀的裂酸。将膜锚定旋转柱转移到新的 1.5 毫升管中。通过将 30 微升无 RNase 水添加到柱中，关闭柱盖，并在室温下保持 5 分钟，溶解总 RNA。

然后在 15，000 次 G 下旋转列一分钟。将含有总RNA的样品转移到冰上新的微离心管中，通过分光光度法测量总RNA的浓度。根据手稿方向准备主混合溶液，并在八井管条的每个管中添加八微升。

调整总RNA密度后，将总RNA的12微升等分放入每个管中，并关闭瓶盖。离心管15秒。将管子放入热循环器中，在37摄氏度下孵育60分钟。

完成后，立即孵育5分钟，在95摄氏度下合成cDNA。将cDNA转移到新的1.5毫升微离心管中，用蒸馏水稀释10次。漩涡和离心管五秒钟，然后执行定量实时PCR，如文本手稿中所述。

该协议用于在重达20至25克的8周大雄性小鼠中通过左尿道结扎创建单性尿道阻塞小鼠模型。用4-0丝线线进行双连结完全阻碍。肾脏在手术后八天内被收集。

microRNA qRT-PCR数据表明，与对联小鼠肾脏相比，微RNA3070-3p水平显著提高，UUO小鼠肾脏的微RNA、7218-5p和微RNA7219-5p水平降低。尝试此协议时，请记住反复扭曲肾脏样本，直到它完全溶解在苯基/瓜尼丁基解压试剂中，以实现良好的RNA提取。