Este método permite proporcionar expresión de microARN en riñones de ratones con una amplia gama de afecciones patológicas, como la fibrosis renal. La principal ventaja de esta técnica es que permite el perfilado de expresiones de microARN con alta precisión y sensibilidad mediante el uso de un proceso simple que ahorra tiempo y evita errores técnicos. Para realizar la cirugía falsa, utilice tijeras quirúrgicas y pinzas para hacer una incisión en la piel en el abdomen y cortar el músculo y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.
Humedezca dos hisopos de algodón con PBS y tire cuidadosamente de los intestinos hacia un lado. Coloque los hisopos humedecidos para identificar el riñón izquierdo y el uréter. Cierre la membrana peritoneal y luego la incisión con nylon 4-0.
Para realizar la obstrucción uretral unilateral, o UUO, haga una incisión en la piel en el abdomen y corte el músculo y la membrana peritoneal como se demostró para la cirugía falsa. Coloque una jeringa de 2,5 mililitros debajo del ratón. Humedezca dos hisopos de algodón con PBS, luego tire de los intestinos cuidadosamente hacia un lado con las pinzas y coloque los hisopos para identificar el uréter izquierdo.
Use las pinzas para levantar el riñón izquierdo. Use 4-0 de seda para ligar el uréter izquierdo en dos lugares de aproximadamente un centímetro de distancia. Corte el uréter en el punto central de las dos ligaduras y luego use suturas de nylon 4-0 para cerrar la membrana peritoneal y la incisión.
Después de cortar la membrana peritoneal, como se ha demostrado anteriormente, levantarla con pinzas y utilizar tijeras quirúrgicas para hacer una incisión lateral en el borde superior, luego continuar la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas. Identifique el riñón izquierdo y reflujo con PBS hasta que el riñón se vuelva amarillo-blanco. Retire el riñón cortando la arteria renal izquierda y la vena con las tijeras quirúrgicas y colóquelo en una placa de Petri, luego lávelo cuidadosamente con PBS.
Cortar el riñón en muestras de aproximadamente 10 miligramos con las tijeras quirúrgicas y pinzas, poner cada pedazo del riñón en su propio tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y cerrar la tapa del tubo. Ponga una muestra de riñón en el homogeneizador de silicona y agregue 700 microlitros de un reactivo de lysis a base de fenilo/guanidina. Presione y retuerza lentamente el peste del homogeneizador contra la muestra de riñón para homogeneizarla.
Repita el prensado y la torsión hasta que la muestra se disuelva por completo en el reactivo de lelisis. Para homogeneizar aún más la muestra, transfiera el izado homogeneizado a la columna de giro del biopolímero y gírrela a 14.000 veces G durante tres minutos, luego transfiera el izado precipitado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros no utilizado. Combine el ésato en el tubo con 140 microlitros de cloroformo y tapón el tubo firmemente.
Para mezclar el izado y el cloroformo, invierta el tubo 15 veces. Incubar las muestras durante dos o tres minutos a temperatura ambiente, luego girarlas a 12.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Sin perturbar el precipitado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y agregue 1,5 veces su volumen de 100% etanol.
Vórtice la mezcla durante cinco segundos. Cargue 700 microlitros de la muestra en una columna de centrifugado anclada a membrana en un tubo de recogida de dos mililitros. Cierre la tapa de la columna y gire la columna a 15.000 veces G durante 15 segundos y, a continuación, tire el izado precipitado en el tubo de recogida.
Lave bien la muestra añadiendo 700 microlitros de tampón de lavado uno a la columna de centrifugado anclada a la membrana en un tubo de recogida de dos mililitros. A continuación, repita la centrifugación y tire el tubo de recogida. Repita el lavado dos veces con 500 microlitros de tampón de lavado dos por lavado.
Después del último lavado, gire la columna de espín anclada a la membrana en un tubo de recogida de dos mililitros a 15.000 veces G durante un minuto y tire el lysate precipitado. Transfiera la columna de centrifugado anclada a la membrana a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Disuelva el ARN total añadiendo 30 microlitros de agua libre de RNase a la columna, cierre la tapa de la columna y déjela durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego gira la columna a 15.000 veces G durante un minuto. Transfiera la muestra que contiene ARN total a un nuevo tubo de microcentrífuga sobre hielo y mida la concentración de ARN total por espectrofotometría. Prepare una solución de mezcla maestra de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y agregue ocho microlitros a cada tubo de una tira de tubo de ocho pozos.
Después de ajustar la densidad total de ARN, coloque una alícuota de 12 microlitros del ARN total en cada tubo y cierre la tapa. Centrifugar los tubos durante 15 segundos. Poner los tubos en el termociclo e incubarlos durante 60 minutos a 37 grados centígrados.
Cuando haya terminado, incubarlos inmediatamente durante cinco minutos a 95 grados centígrados para la síntesis de ADNc. Transfiera el ADNc a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y diluya 10 veces con agua destilada. Vórtice y centrifugar el tubo durante cinco segundos, luego realizar PCR cuantitativo en tiempo real, como se describe en el manuscrito de texto.
Este protocolo se utilizó para crear un modelo unilateral de ratón de obstrucción uretral a través de la ligadura ureteral izquierda en ratones macho de ocho semanas de edad que pesan de 20 a 25 gramos. Los uréteres estaban completamente obstruidos por doble ligadura con 4-0 suturas de seda. Los riñones se recolectaron a los ocho días después de la cirugía.
Los datos de microRNA qRT-PCR indicaron que el nivel de microRNA 3070-3p aumentó significativamente y los niveles de microARN, 7218-5p y microRNA 7219-5p disminuyeron en los riñones de los ratones UUO en comparación con los controles. Al intentar este protocolo, recuerde repetir la torsión de la muestra de riñón hasta que se disuelva completamente en el reactivo de lysis a base de fenilo/guanidina para lograr una buena extracción de ARN.
