过去，使用表面结合探针的单分子FRET实验几乎完全在固定的分子上进行。然而，许多生物分子扩散，可以用我们的方法进行分析。将单分子FRET与跟踪相结合，不仅可以分析移动探针的FRET缺陷时间痕迹，还可以研究扩散行为等时空方面。
我们的方法与各种不同的基于FRET的探头兼容。例如，它可以提供有关活细胞实验中分子力，构象动力学和结合动力学的见解。众所周知，高质量的单分子FRET实验很难进行。
为了进行可靠的定量，重要的是要以良好的信噪比和足够长度的单分子轨迹记录数据。要开始样品测量，请在触发相机的同时激发供体和受体荧光团适当的照明时间，并等待相机读数启用。交替重复激发供体和受体荧光团。
选择足够大的重复次数，以确保每个探针在视场内至少一个荧光团的光漂白，从而允许逐步光漂白分析以区分单分子信号和聚集体。指定照明序列，以允许选择供体和受体激发帧以及用于从记录的图像序列中分割图像的帧。同时，分析使用相同的照明设置记录的数据集。
为此，请为每个数据集分配一个标识符和一个与相应图像序列文件名匹配的模式。此外，为特殊目的定义特定数据集，例如记录用于图像配准的基准标记，用于平坦场校正的激发光曲线，以及可选的仅供体和仅受体样本以确定校正因子。接下来，如果发射通道和原始图像都是使用单个相机录制的，请选择发射通道和原始图像。
为此，请使用适当的图形小部件为供体和受体发射选择适当的区域，然后在两个发射通道中定位基准标记并执行图像配准。使用提供的用户界面查找供体和受体发射通道的定位算法的相应参数。接下来，在供体激发时，以从供体和受体发射获得的图像的总和设置供体激发时FRET探针的单分子定位参数，然后在受体发射通道中为受体激发时的探针设置定位参数。
在所有帧中独立地将供体和受体激发定位FRET探针。结果将合并到一个表中，该表包含原始帧编号、二维坐标和引用源图像文件的标识符。要跟踪和测量荧光强度，请为Trackpy算法选择适当的选项，以将FRET探针定位链接到轨迹。
接下来，使用分析软件功能，处理来自图像序列的辅助图像数据。提取记录的其他图像，以利于在激发序列中用S标记的分割。最后，从密集标记的样品上记录的图像中确定整个视野中的供体和受体激发光曲线。
对于初始滤波步骤，丢弃具有重叠点扩散函数的信号，因为很难可靠地确定其荧光强度。在不均匀照明的情况下，仅接受位于视场内照明良好的区域的信号，以确保良好的信噪比。如果研究分子内FRET，请将分析限制在从图像序列开始存在的那些轨迹上。
接下来，执行平坦场校正，该校正使用先前获得的激发光源轮廓来反转由不均匀照明引起的位置相关荧光强度变化，然后计算表观FRET效率和表观化学计量。为了对光漂白进行逐步分析以区分单分子探针和聚集体，请在供体和受体激发下独立找到变化点检测算法的适当参数。然后执行变化点检测算法。
要移除显示模棱两可的光漂白行为的轨迹，请定义荧光团被视为漂白的强度阈值，然后选择以下选项之一。选项一，其中受体荧光团在单个步骤中漂白，而供体没有显示部分漂白。备选方案二，其中供体在单个步骤中漂白，而没有部分受体漂白。
选项三，其中任一荧光团漂白在一个步骤中，而另一个不部分漂白。而选项四，其中供体和受体荧光团显示单步光漂白或根本没有光漂白。然后计算供体排放泄漏到受体通道、直接受体激励、检测效率和激励效率的校正因子。
接下来，使用校正因子从表观效率计算FRET效率，从表观化学计量计算化学计量学。要进一步过滤，请仅选择每个轨迹中第一个漂白事件之前的数据点。此外，要将分析限制为单分子探针，请仅接受在适当化学计量限制内至少有75%数据点的轨迹。
然后，通过全局或自适应阈值方法对相应的辅助图像执行图像分割，以将分析限制在视野内的不同区域。创建效率与化学计量图，以验证是否已正确识别和删除不正确化学计量的信号。然后绘制 FRET 效率的直方图，以提供 FRET 效率分布的完善概述，并对直方图进行分组，以便于比较不同实验的结果。
利用科学的Python库，可以进一步评估笔记本中的数据，例如执行扩散分析。此处显示了单分子 FRET 事件的可视化和跟踪。滤波的 FRET 事件由 FRET 效率直方图中的效率与化学计量图表示。
此外，可以通过在 XY 图或均方位移图中绘制单个轨迹路径来研究移动参数。我们平台的输出使我们能够进一步识别移动探头的FRET效率时间轨迹的转换。例如，评估生物分子的构象变化。
使用基于FRET的力传感器，分析平台使我们能够量化早期T细胞信号传导期间免疫突触中的单分子力事件。
