研究结肠癌干细胞的球体三维模型

这种球形培养的新方法可用于研究肿瘤原性，分析不同人群的癌症干细胞的存在，也可以很好地应用于通过高放屏的新药。这是一个强大和重复的培养系统，用于生成大量均匀大小的球体。此外，这些球体可用于研究癌干细胞。

这种方法是为了研究慢性癌症生物学而建立的，但通过改变3D培养条件，可以很容易地建立起来研究其他癌症。一定要注意介质中的气泡，在球体形成过程中不要移动盘子太多，在将球体收集到滤网时要小心。首先对每口井500微升防粘性冲洗液的24口井板进行预处理。

几秒钟后，将板在摆动桶转子中离心，用2毫升温暖的玄武岩介质冲洗每口油井。观察显微镜下的板，以确保气泡已完全从微井中去除。如果没有观察到气泡，请再次冲洗油井，然后再向每口井添加一毫升温暖的DMEM地下室膜基质介质。

要诱导球体形成，请参阅 DMEM 中 10 厘米的盘中 10 厘米盘中 2D 单层中 Caco-2 细胞的预期浓度，并辅以 10% FBS 和 1% 抗生素。在37摄氏度和5%的潮湿大气中培养。当达到80%的汇合度时，用五毫升PBS清洗细胞，然后用两毫升的Trypsin-EDTA在37摄氏度和5%的二氧化碳下处理培养物两到五分钟。

当细胞分离中和特里普辛与四毫升完整的DMEM。计数后，通过离心收集细胞，并以适当体积的 DMEM 基层基质基质介质重新分配调色板，以达到每口井一毫升中等细胞的预期浓度。在预付费 24 油井板的每口井中加入一毫升细胞，然后向每口井添加一毫升 DMEM 基膜基质介质。

播种后，立即离心板，并使用光显微镜，以验证细胞已均匀分布在微井。然后将盘子放在细胞培养孵化器中48小时，而不会干扰细胞。要收获球体，在孵化结束时，使用血清学移液器和每口井中一半的超自然物轻轻地将球体从其微井中分离。

当所有球体都分离后，使用移液器将 3D 培养物从每口井小心地转移到 15 毫升圆锥管顶部的 37 微米可逆滤应变器。每口井洗三次，每次洗一毫升预热的Basal介质，以收集任何剩余的球体，并将这些额外的球体添加到过滤器中。最后一次洗涤后，检查显微镜下的板，以确认所有球体已从微井中去除。

然后将滤网倒置到新的 15 毫升管上，用新鲜的 DMEM 底层膜基质介质清洗滤网底部，将球体收集到管中。球体从500个细胞中上升，表明随着时间的推移，其大小会增加最均匀。球体外围有500和600个细胞，确定是实现良好生长和低变异性的最佳细胞数量。

地下室膜基质的添加可增强球体生长和均匀性。在长期培养中，细胞在第三天以密集的多层身份出现。虽然在单层中排列的扁平细胞在第 10 天清晰可见。

有趣的是，从第五天开始，球体中就出现了流明。此外，在第5天和第7天观察到增殖细胞核抗原阳性细胞明显增加，到第10天下降。令人惊讶的是，激活的Caspace3只在第三天和第五天在极少数细胞中观察到。

虽然每个时间点都观察到高水平的β-卡泰宁表达。球体分化成前体的潜力从其碱性磷酸盐和溶解载体家族2A5 mRNA表达中得到了证明。此外，这种球形表示典型的癌症干细胞标记，并响应常规给结肠直肠癌患者施用的联合化疗治疗。

因此，球体由不同的细胞群组成。然后，它们可以很好地用于分析细胞对刺激（如耐火器）的特异性反应，并最终用于药物反应。