Этот новый метод сфероидных культур может быть использован для изучения опухолевой для анализа присутствия различных популяций раковых стволовых клеток, а также может быть красиво применяется для через высокий экран положить для новых препаратов. Это надежная и повторяющаяся культурная система для генерации большого количества однородных сфероидов. Кроме того, эти сфероиды могут быть использованы для изучения раковых стволовых клеток.
Этот метод создан для изучения биологии хронического рака, но он может быть легко создан для изучения других видов рака путем изменения условий 3D культуры. Будьте уверены, чтобы следить за пузырьками в среде, чтобы не перемещать пластину слишком много во время образования сфероидов и быть осторожным при сборе сфероидов в ситечко. Начните с предварительной лечения скважин 24 пластины скважины с 500 микролитров анти-Adherence Rinsing решение на скважину.
Через несколько секунд центрифуга пластины в размахивая-ведро ротора и промыть каждый колодец с 2 миллилитров теплой базальной среды. Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки были полностью удалены из микро скважин. Если пузырьков не наблюдается, промыть скважины снова, прежде чем добавить один миллилитр теплой DMEM подвале мембраны матрицы среды для каждой скважины.
Чтобы вызвать образование сфероидов, увидеть желаемую концентрацию клеток Како-2 в 2D монослой в 10 сантиметров блюдо в DMEM дополняется 10%FBS и 1%антибиотиков. Для культуры при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе во влажной атмосфере. Когда 80%-ного слияния достигнут, мыть клетки с пятью миллилитров PBS перед лечением культуры с двумя миллилитров трипсина-ЭДТА в течение двух-пяти минут при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
Когда клетки отделились нейтрализовать трипсин с четырьмя миллилитров полного DMEM. После подсчета, собирать клетки центрифугации и повторно использовать палитру в соответствующем объеме DMEM подвале мембраны матрицы среды для достижения желаемой концентрации клеток в один миллилитр среднего на колодец. Добавить один миллилитр клеток к каждому хорошо предоплаченных 24 хорошо пластины, а затем добавление одного миллилитра DMEM подвале мембраны матрицы среды для каждого хорошо.
После посева немедленно центрифуга пластины и использовать световой микроскоп, чтобы убедиться, что клетки были равномерно распределены по микро скважин. Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 48 часов, не нарушая клетки. Для сбора сфероидов, в конце инкубации, используйте серологическую пипетку и половину супернатанта в каждой скважине, чтобы аккуратно выбить сфероиды из их микро скважин.
Когда все сфероиды были отделены использовать пипетку, чтобы тщательно передать 3D культур из каждого хорошо до 37 микрон обратимый ситечко на вершине 15 миллилитров конической трубки. Вымойте каждый хорошо три раза с одним миллилитром довоенной базальной среды на стирку, чтобы собрать все оставшиеся сфероиды и добавить эти дополнительные сфероиды в ситечко. После последней стирки проверьте пластину под микроскопом, чтобы подтвердить, что все сфероиды были удалены из микро скважин.
Затем инвертировать ситечко над новой 15 миллилитровой трубки и мыть дно ситечко со свежим DMEM подвале мембраны матрицы среды для сбора сфероидов в трубку. Сфероиды поднимаются из 500 клеток демонстрируют наиболее однородное увеличение размера с течением времени. С 500 и 600 клеток на сфероид определить, чтобы быть оптимальное количество клеток, под которыми хороший рост и низкая изменчивость может быть достигнуто.
Добавление мембранной матрицы подвала усиливает рост сфероидов и однородность. В долгосрочной культуре клетки выглядят как плотные многослойные на третий день. В то время как сплющенные клетки, расположенные в монослоев хорошо видны на 10 день.
Интересно, что люмен появляется в сфероидах с пяти-го дня. Кроме того, явное увеличение размножающихся клеток ядерных антигенных положительных клеток наблюдается в дни пять и семь, что снижается на 10-й день. Удивительно, но активированный Caspace 3 наблюдается в очень немногих клетках только в три и пять дней.
В то время как высокие уровни бета-катенина выражения наблюдаются в каждый момент времени. О потенциале сфероидов дифференцироваться в антерозиты свидетельствует их щелочная фосфатаза и растворимое семейство носителей 2A5 mRNA. Кроме того, эти сфероиды выражают типичные маркеры стволовых клеток рака и реагируют на комбинированные химиотерапии, которые обычно вводят пациентам с колоректальным раком.
Таким образом, сфероиды состоят из различных популяций клеток. Затем они могут быть хорошо использованы для анализа клеточных специфических реакций на раздражители, такие как огнеупоры и в конечном итоге для реакции на наркотики.
