Bu yeni küresel kültürler yöntemi, farklı kanser kök hücrelerinin popülasyonlarının varlığını analiz etmek için tümörojenliği incelemek için kullanılabilir ve ayrıca yeni ilaçlar için yüksek put ekranı aracılığıyla güzel bir şekilde uygulanabilir. Bu, çok sayıda homojen boyutlu küreseloid üretmek için sağlam ve tekrarlayan bir kültürlü sistemdir. Ayrıca, bu sferoidler kanserli kök hücreleri incelemek için kullanılabilir.
Bu yöntem kronik kanser biyolojisini incelemek için ayarlanmıştır, ancak 3D kültür koşullarını değiştirerek diğer kanserleri incelemek için kolayca ayarlanabilir. Ortamdaki kabarcıklara dikkat ettiğinizden, küresel oluşum sırasında plakayı çok fazla hareket ettirmediğinizden ve küreselleri süzgeçe toplarken dikkatli olduğunuzdan emin olun. Kuyu başına 500 mikro litre Yapışma Önleyici Durulama Çözeltisi ile 24 kuyu plakasının kuyularını önceden tedavi ederek başlayın.
Birkaç saniye sonra plakayı sallanan kova rotorunda santrifüj edin ve her birini 2 mililitre sıcak Bazal ortamla durulayın. Kabarcıkların mikro kuyulardan tamamen çıkarıldığından emin olmak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin. Kabarcıklar gözlenmezse, her kuyuya bir mililitre sıcak DMEM bodrum membran matrisi ortamı eklemeden önce kuyuları tekrar durulayın.
Küresel oluşumu teşvik etmek için, DMEM'de %10 FBS ve %1 antibiyotik ile desteklenmiş 10 santimetrelik bir tabakta 2D mono tabaka içinde istenen Caco-2 hücrelerinin konsantrasyonunu görün. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültür için. % 80 izdiah ulaştığında, kültürü iki mililitre Tripsin-EDTA ile tedavi etmeden önce hücreleri beş mililitre PBS ile 37 santigrat derecede iki ila beş dakika yıkayın ve% 5 karbondioksit.
Hücreler ayrıldığında, Trypsin'i dört mililitre tam DMEM ile nötralize eder. Saydıktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve paleti DMEM bodrum membran matrisi ortamının uygun hacminde yeniden biriktirerek kuyu başına bir mililitre orta hücre konsantrasyonunu elde edin. Ön ödemeli 24 kuyu plakasının her kuyusuna bir mililitre hücre ekleyin, ardından her kuyuya bir mililitre DMEM bodrum membran matrisi ortamı ekleyin.
Tohumlamadan sonra, plakayı hemen santrifüjlayın ve hücrelerin mikro kuyulara eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için hafif bir mikroskop kullanın. Daha sonra plakayı hücreleri rahatsız etmeden 48 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Küreselleri hasat etmek için, inkübasyonun sonunda, sferoidleri mikro kuyularından hafifçe çıkarmak için her kuyuda serolojik bir pipet ve süpernatantın yarısını kullanın.
Tüm küreseller ayrıldığında, pipeti kullanarak 3D kültürleri her kuyudan 15 mililitrelik konik tüpün üstündeki 37 mikron ters çevrilebilir süzgeçe dikkatlice aktarın. Kalan küreselleri toplamak için yıkama başına bir mililitre önceden uyarılmış Bazal ortam ile her kuyuyu üç kez yıkayın ve bu ek sferoidleri süzgeçe ekleyin. Son yıkamadan sonra, tüm küresellerin mikro kuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için mikroskop altındaki plakayı kontrol edin.
Daha sonra süzgeci yeni bir 15 mililitrelik tüp üzerinde ters çevirin ve sferoidleri tüpe toplamak için süzgecin altını taze DMEM bodrum membran matrisi ortamı ile yıkayın. 500 hücreden yükselen küreseller zaman içinde en homojen boyut artışını göstermektedir. Küresel başına 500 ve 600 hücre ile iyi büyüme ve düşük değişkenlik elde edilebilirlik elde edilebilir hücre en uygun sayıda olduğunu belirleyin.
Bodrum membran matrisinin eklenmesi küresel büyümeyi ve homojenliği arttırır. Uzun vadeli kültürde, hücreler üçüncü günde yoğun çok katmanlı olarak görünür. Tek katmanlı olarak düzenlenmiş düzleştirilmiş hücreler 10.
İlginçtir ki, beşinci günden itibaren küresellerde bir lümen beliriyor. Buna ek olarak, çoğalan hücre nükleer antijen pozitif hücrelerinde 10. Şaşırtıcı bir şekilde, aktif Caspace 3 sadece üç ve beş günlerinde çok az hücrede gözlenir.
Her zaman noktasında yüksek düzeyde Beta-catenin ekspresyolü gözlenirken. Küresellerin Anterositlere farklılaşma potansiyeli, Alkali Fosfataz ve çözünen taşıyıcı ailesi 2A5 mRNA ekspresyosu ile kanıtlanır. Ek olarak, bu küreseller tipik kanser kök hücre belirteçlerini ifade eder ve kolorektal kanser hastalarına rutin olarak uygulanan kombinasyon kemoterapi tedavilerine yanıt verir.
Yani küreseller farklı hücre popülasyonlarından oluşur. Daha sonra refrakterler gibi uyaranlara verilen hücre spesifik yanıtlarını analiz etmek ve sonunda ilaç yanıtları için güzel bir şekilde kullanılabilirler.
