Este novo método de culturas esferoides pode ser usado para estudar a tumorigenicidade para analisar a presença de diferentes populações de células-tronco cancerígenas e também pode ser bem aplicado através de tela de alta colocação para novas drogas. Trata-se de um sistema robusto e repetitivo para gerar um grande número de esferoides de tamanho homogêneo. Além disso, esses esferoides podem ser usados para estudar células-tronco cancerígenas.
Este método é criado para estudar a biologia crônica do câncer, mas pode ser facilmente criado para estudar outros cânceres alterando as condições de cultura 3D. Certifique-se de observar bolhas no meio, para não mover muito a placa durante a formação de esferoides e ter cuidado ao colher os esferoides no coador. Comece por pré-tratar os poços de uma placa de 24 poços com 500 micro litros de Solução anti-adesão por poço.
Depois de alguns segundos centrifugar a placa em rotor de balde balançando e enxaguar cada poço com 2 mililitros de meio basal quente. Observe a placa sob o microscópio para garantir que as bolhas tenham sido completamente removidas dos micro-poços. Se não forem observadas bolhas, enxágue os poços novamente antes de adicionar um mililitro de matriz de membrana de porão de DMEM quente meio para cada poço.
Para induzir a formação de esferoides, consulte a concentração desejada de células Caco-2 em uma camada mono 2D em um prato de 10 centímetros em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1%antibióticos. Para a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma atmosfera umidificada. Quando uma confluência de 80%, lave as células com cinco mililitros de PBS antes de tratar a cultura com dois mililitros de Trypsin-EDTA por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Quando as células se separarem neutralizar a Trippsina com quatro mililitros de DMEM completos. Após a contagem, colete as células por centrifugação e resuspense a paleta no volume apropriado do meio de matriz de membrana de porão do DMEM para alcançar a concentração desejada das células em um mililitro de médio por poço. Adicione um mililitro de células a cada poço da placa pré-paga de 24 poços, seguido pela adição de um mililitro de matriz de membrana de porão DMEM médio para cada poço.
Após a semeadura, centrifufique imediatamente a placa e use um microscópio leve para verificar se as células foram distribuídas uniformemente pelos micro poços. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 48 horas sem perturbar as células. Para colher os esferoides, no final da incubação, use uma pipeta sorológica e metade do supernazio em cada poço para desalojar suavemente os esferoides de seus micro poços.
Quando todos os esferoides tiverem sido destacados use a pipeta para transferir cuidadosamente as culturas 3D de cada poço para um coador reversível de 37 mícrons em cima de um tubo cônico de 15 mililitros. Lave cada poço três vezes com um mililitro de meio basal pré-armado por lavagem para coletar quaisquer esferoides restantes e adicione estes esferoides adicionais ao coador. Após a última lavagem verifique a placa sob o microscópio para confirmar que todos os esferoides foram removidos dos micro poços.
Em seguida, inverta o coador sobre um novo tubo de 15 mililitros e lave a parte inferior do coador com o meio de matriz de membrana de porão DMEM fresco para coletar os esferoides no tubo. Os spheróides estão subindo de 500 células demonstram o aumento mais homogêneo do tamanho ao longo do tempo. Com 500 e 600 células por esferoide determinam ser o número ideal de células sob as quais um bom crescimento e baixa variabilidade podem ser alcançados.
A adição da matriz de membrana do porão aumenta o crescimento esferoide e a homogeneidade. Na cultura de longo prazo, as células aparecem como densas multi camadas no terceiro dia. Enquanto células achatadas dispostas em camadas mono são claramente visíveis no dia 10.
Curiosamente, um lúmen aparece dentro dos esferoides a partir do quinto dia. Além disso, um claro aumento na proliferação de células nucleares células positivas células células positivas é observado nos dias cinco e sete que diminui até o dia 10. Surpreendentemente, o Caspace 3 ativado é observado em pouquíssimas células apenas nos dias três e cinco.
Enquanto altos níveis de expressão beta-catenin são observados em todos os pontos de tempo. O potencial dos esferoides para se diferenciar em anterosites é evidenciado por sua expressão alkalina fosfattase e séute carrier 2A5 mRNA. Além disso, esses esferoides expressam marcadores típicos de células-tronco do câncer e respondem a tratamentos de quimioterapia combinados rotineiramente administrados a pacientes com câncer colorretal.
Então os esferoides são compostos de diferentes populações celulares. Eles então podem ser bem usados para analisar respostas específicas das células a estímulos como refratários e, eventualmente, para respostas de medicamentos.
