Este nuevo método de culturas esferoides se puede utilizar para estudiar el tumorigenicity para analizar la presencia de diversas poblaciones de células madres del cáncer y también se puede aplicar muy bien a para a través de la pantalla del alto put para las nuevas drogas. Este es un sistema cultivado robusto y repetitivo para generar un gran número de esferoides de tamaño homogéneo. Además, estos esferoides se pueden utilizar para estudiar las células madre cancerosas.
Este método está configurado para estudiar la biología del cáncer crónico, pero se puede configurar fácilmente para estudiar otros tipos de cáncer cambiando las condiciones del cultivo 3D. Asegúrese de estar atento a las burbujas en el medio, para no mover demasiado la placa durante la formación de esferoides y tener cuidado al cosechar los esferoides en el colador. Comience por pre-tratar los pozos de una placa de 24 pozos con 500 micro litros de solución de enjuague antia adherencia por pozo.
Después de unos segundos centrífuga la placa en rotor de cubo oscilante y enjuague cada pozo con 2 mililitros de medio basal caliente. Observe la placa bajo el microscopio para asegurarse de que las burbujas se han eliminado por completo de los micro pozos. Si no se observan burbujas, enjuague los pozos de nuevo antes de agregar un mililitro de medio de matriz de membrana basal DMEM caliente a cada pozo.
Para inducir la formación de esferoides, ver la concentración deseada de células Caco-2 en una monocapa 2D en un plato de 10 centímetros en DMEM complementado con 10%FBS y 1%antibióticos. Para el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una atmósfera humidificada. Cuando se alcance una confluencia del 80%, lave las células con cinco mililitros de PBS antes de tratar el cultivo con dos mililitros de Tripsina-EDTA durante dos a cinco minutos a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Cuando las células se han desprendido neutralizar la tripsina con cuatro mililitros de DMEM completo. Después de contar, recoger las células por centrifugación y resuspend la paleta en el volumen apropiado de dmem sótano de la matriz de la matriz para lograr la concentración deseada de células en un mililitro de medio por pozo. Agregue un mililitro de células a cada pozo de la placa de 24 pozos prepagada, seguido de la adición de un mililitro de medio de matriz de membrana basal DMEM a cada pozo.
Después de la siembra, centrifugue inmediatamente la placa y use un microscopio de luz para verificar que las células se hayan distribuido uniformemente a través de los micro pozos. Luego coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas sin perturbar las células. Para cosechar los esferoides, al final de la incubación, utilice una pipeta serológica y la mitad del sobrenadante en cada pozo para desalojar suavemente los esferoides de sus micro pozos.
Cuando todos los esferoides se han separado, use la pipeta para transferir cuidadosamente los cultivos 3D de cada pozo a un colador reversible de 37 micras en la parte superior de un tubo cónico de 15 mililitros. Lave cada pozo tres veces con un mililitro de medio basal precalñado por lavado para recolectar los esferoides restantes y agregue estos esferoides adicionales al colador. Después del último lavado, revise la placa bajo el microscopio para confirmar que todos los esferoides se han eliminado de los micro pozos.
Luego invierta el colador sobre un nuevo tubo de 15 mililitros y lave la parte inferior del colador con un medio fresco de matriz de membrana basal DMEM para recoger los esferoides en el tubo. Los esferoides están aumentando de 500 células demuestran el aumento más homogéneo en tamaño en un en un plazo. Con 500 y 600 células por esferoide determinar que es el número óptimo de células bajo las cuales se puede lograr un buen crecimiento y baja variabilidad.
La adición de la matriz de la membrana del sótano aumenta crecimiento y homogeneidad del esferoide. En cultivo a largo plazo, las células aparecen como densas capas múltiples en el tercer día. Mientras que las células aplanadas dispuestas en mono capas son claramente visibles en el día 10.
Curiosamente, un lumen aparece dentro de los esferoides desde el quinto día en adelante. Además, un aumento claro en células positivas del antígeno nuclear de la célula de la proliferación se observa en los días cinco y siete que disminuye por el día 10. Sorprendentemente, caspace activado 3 se observa en muy pocas células en los días tres y cinco solamente.
Mientras que los altos niveles de expresión de beta-catenina se observan en cada punto de tiempo. El potencial de los esferoides para diferenciarse en anterositas es evidenciado por su fosfatasa alcalina y expresión de la familia de portadores de soluto 2A5 mRNA. Además, estos esferoides expresan marcadores típicos de células madre cancerosas y responden a los tratamientos de quimioterapia combinada administrados rutinariamente a pacientes con cáncer colorrectal.
Así que los esferoides están compuestos de diferentes poblaciones celulares. Entonces se pueden utilizar muy bien para analizar las respuestas específicas de la célula a los estímulos tales como refractores y eventual para las respuestas de la droga.
