Diese neue Methode der Sphäroidkulturen kann verwendet werden, um die Tumorigenität zu untersuchen, um das Vorhandensein verschiedener Populationen von Krebsstammzellen zu analysieren und kann auch schön auf durch High Put Screen für neue Medikamente angewendet werden. Dies ist ein robustes und sich wiederholendes kultiviertes System zur Erzeugung einer großen Anzahl homogener Sphäroide. Darüber hinaus können diese Sphäroide verwendet werden, um krebserende Stammzellen zu untersuchen.
Diese Methode wurde eingerichtet, um chronische Krebsbiologie zu studieren, aber es kann leicht eingerichtet werden, um andere Krebsarten zu studieren, indem die 3D-Kulturbedingungen geändert werden. Achten Sie darauf, auf Blasen im Medium zu achten, die Platte während der Sphäroidbildung nicht zu sehr zu bewegen und vorsichtig zu sein, wenn Sie die Sphäroide in das Sieb ernten. Beginnen Sie mit der Vorbehandlung der Brunnen einer 24 WellPlatte mit 500 Mikroliter Anti-Adherence Rinsing Solution pro Brunnen.
Nach ein paar Sekunden zentrifugieren Sie die Platte im Schwingen-Schaufelrotor und spülen Sie jeden Brunnen mit 2 Milliliter warmes Basalmedium. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Blasen vollständig aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wenn keine Blasen beobachtet werden, spülen Sie die Brunnen erneut, bevor Sie jeweils einen Milliliter warme DMEM-Kellermembranmatrix zu jedem Brunnen hinzufügen.
Um die Sphäroidbildung zu induzieren, sehen Sie die gewünschte Konzentration von Caco-2-Zellen in einer 2D-Monoschicht in einer 10-Zentimeter-Schale in DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika. Für die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Atmosphäre. Wenn eine Konvexität von 80 % erreicht ist, waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS, bevor Sie die Kultur mit zwei Millilitern Trypsin-EDTA zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid behandeln.
Wenn die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit vier Millilitern vollständiger DMEM. Nach dem Zählen die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Palette im entsprechenden Volumen des DMEM-Kellermembranmatrixmediums wieder aufsetzen, um die gewünschte Konzentration der Zellen in einem Milliliter Medium pro Brunnen zu erreichen. Fügen Sie jedem Brunnen der Prepaid 24 Well Platte einen Milliliter Zellen hinzu, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter DMEM-Kellermembranmatrixmedium zu jedem Brunnen.
Nach der Aussaat zentrieren Sie die Platte sofort und verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig über die Mikrobrunnen verteilt wurden. Dann legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für 48 Stunden, ohne die Zellen zu stören. Um die Sphäroide am Ende der Inkubation zu ernten, verwenden Sie eine serologische Pipette und die Hälfte des Überstandes in jedem Brunnen, um die Sphäroide sanft aus ihren Mikrobrunnen zu entfernen.
Wenn alle Sphäroide abgetrennt sind, verwenden Sie die Pipette, um die 3D-Kulturen von jedem Brunnen vorsichtig auf ein 37 Mikron reversibles Sieb auf einem 15 Milliliter konischen Rohr zu übertragen. Waschen Sie jeden Brunnen dreimal mit einem Milliliter vorgewärmten Basalmedium pro Wäsche, um alle verbleibenden Sphäroide zu sammeln und fügen Sie diese zusätzlichen Sphäroide zum Sieb hinzu. Nach der letzten Wäsche überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass alle Sphäroide aus den Mikrobrunnen entfernt wurden.
Dann das Sieb über ein neues 15-Milliliter-Rohr umkehren und den Boden des Siebs mit frischem DMEM-Kellermembran-Matrixmedium waschen, um die Sphäroide in das Rohr zu sammeln. Sphäroide steigen aus 500 Zellen und weisen im Laufe der Zeit den homogensten Größenzuwachs auf. Mit 500 und 600 Zellen pro Sphäroid bestimmen, um die optimale Anzahl von Zellen zu sein, unter denen gutes Wachstum und geringe Variabilität erreicht werden können.
Die Zugabe von Kellermembranmatrix verbessert das Sphäroidwachstum und die Homogenität. In der Langzeitkultur erscheinen die Zellen an Tag drei als dichte Multi-Layer. Während abgeflachte Zellen, die in Monoschichten angeordnet sind, an Tag 10 deutlich sichtbar sind.
Interessanterweise erscheint ein Lumen innerhalb der Sphäroide ab dem fünften Tag. Darüber hinaus wird an den Tagen fünf und sieben, die am Tag 10 abnehmen, ein deutlicher Anstieg der proliferierenden zellnuklearen Antigen-positiven Zellen beobachtet. Überraschenderweise wird der aktivierte Caspace 3 nur an den Tagen drei und fünf in sehr wenigen Zellen beobachtet.
Während hohe Konzentrationen der Beta-Catenin-Expression zu jedem Zeitpunkt beobachtet werden. Das Potenzial der Sphäroide, sich in Anterositen zu differenzieren, wird durch ihre Alkaline Phosphatase und die solute Trägerfamilie 2A5 mRNA-Expression belegt. Darüber hinaus exprimieren diese Sphäroide typische Krebsstammzellmarker und reagieren auf Kombinations-Chemotherapie-Behandlungen, die regelmäßig an Darmkrebspatienten verabreicht werden.
Sphäroide bestehen also aus verschiedenen Zellpopulationen. Sie können dann schön verwendet werden, um zellspezifische Reaktionen auf Reize wie Refrakszen und schließlich für Arzneimittelreaktionen zu analysieren.
