一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案

小鼠原代肝细胞在肝脏研究中很重要。特别适用于葡萄糖代谢和肝脏药物检测。从时间上讲，隔离过程可能非常耗时且能源昂贵。

该协议可以提供一种有效的方法来分离小鼠原代肝细胞。这是时间和劳动友好的。对于所有区域，只需很少的步骤即可实现。

首先使用蠕动泵开始以每分钟4 mL的速度泵送预热的双蒸馏水，持续5分钟。然后将泵送管从水改为预热的灌注介质。监测水和灌注介质之间的气泡。

将有助于跟踪灌注介质通过系统的流动。接下来用70%乙醇对麻醉的八周龄C57黑6J雌性小鼠的腹部进行消毒。并用剪刀切开腹部，露出肝脏，门静脉和下腔静脉。

然后停止蠕动泵。在确保泵送管中含有灌注介质而不是水之后。将 24 号导管插入下腔静脉。

重新打开泵，切开门静脉。在泵送灌注介质时，每分钟按压门静脉，让液体到达肝脏的每个角落。继续泵送约三到五分钟，或直到冲洗出的液体变清。

接下来将泵送管从灌注培养基改为胶原酶分散酶培养基。并每分钟按压门静脉，让液体到达肝脏的每个角落。继续泵送，直到所有 25 mL 胶原酶分散酶培养基耗尽。

接下来分离整个肝脏，没有胆囊。并将其置于30 mL洗涤培养基中，置于冰上的培养皿中。使用镊子将肝脏撕成碎片，将原代肝细胞释放到溶液中。

在这个阶段，洗涤培养基变成含有释放的原代肝细胞和小肝碎片的浑浊溶液。通过70微米的细胞过滤器过滤这种浑浊的溶液，在50 mL的冰管中加入20 mL，每次调用1X HBSS。并通过倒置管子20次来混合溶液。

接下来离心溶液。然后在组织培养罩中，吸出上清液。并用30mL冷洗培养基洗涤沉淀。

再次用离心沉淀细胞。除去上清液，并将沉淀重新悬浮在25mL培养基中。计数细胞并将其接种在所需的培养板上。

根据实验设计。接种后，分离的原代肝细胞牢固附着1小时，12小时后完全扩增。在分离的肝细胞中，与整个肝脏相比，肝细胞标志物（如转甲状腺素，CD95，ASGR1和ASGR2）的mRNA水平显着增加。

相比之下，免疫细胞，星状细胞和内皮细胞的存在较低。CD45、胶原蛋白 1 型 α 1 和内皮细胞 2 激酶 2 mRNA 水平急剧下降。这表明该方案可以大大减少来自其他肝细胞的干扰。

电镀后，ASGR1和ASGR2水平随时间下降，但直到12小时时间点仍与整个肝脏相当。特别是对于ASGR1。膜结合CD81的表达水平在长达48小时内保持一致。

相比之下，Toll样受体4的表达通常在48小时后增加并变得高于体内水平。胰岛素敏感性测定表明，胰岛素在丝氨酸473处显着促进两种AKT的磷酸化。叉头盒01在丝氨酸256处，在肝细胞中。

表明原发性肝细胞对胰岛素的敏感性。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶蛋白水平在胰高血糖素处理后显著升高。表明葡萄糖产生途径被激活。

这种激活通过增加葡萄糖产生得到进一步证实。还有其他葡萄糖生产刺激剂，如毛喉素+ IBMX。该方案可以节省使用小鼠原代肝细胞研究的时间和精力。

按照该协议，可以进行相关实验，例如假设的葡萄糖代谢和药物生物标志物测定。