非放射性 l-azidohomoalanine 标记法分离原发性小鼠肝细胞对新生蛋白合成的研究

该方法有助于回答各种代谢疾病研究领域有关肥胖、非酒精性脂肪肝和二型糖尿病中肝能和蛋白质生物合成分子变化的关键问题。该技术的主要优点是，它便于通过非放射性标签基板分离功能性原位小鼠肝细胞和检测肝新生蛋白。这种方法的视觉演示是至关重要的，因为灌注步骤是很难学习，因为小和薄的小鼠血管。

对于肝脏灌注，小心插入24表导管到劣质维纳卡瓦或 IVC 只是在分叉与正确的肾静脉。拆下导管针，保持 IVC 内导管的位置，并使用连接器将 24 表导管与灌注管连接。开始用温暖的HSS减去四毫升的永久流速来循环肝脏，迅速切断静脉，排出内部血液。

10分钟后，用35毫升的HBVS加上辅以胶原蛋白X型的胶原蛋白，以每分钟4毫升的流量，每隔几分钟夹住10秒左右的静脉，以方便整个肝脏的香水分布。当所有的胶原蛋白酶被注入时，在停止泵之前将肝脏转移到实验室组织上，以避免血液回流到肝脏中。使用钳子切除胆囊，然后用新鲜的实验室组织轻轻擦拭肝脏以去除任何血液。

将肝脏放在含有5毫升新鲜温暖HPS的100毫米培养皿中，并辅以胶原蛋白酶，并使用杂散的钳子轻轻取出肝脏胶囊。使用钳子小心地分散的皮毛组织，并在培养皿中加入15毫升冷DMEM。轻轻摇动撕裂的肝脏，将残留的白细胞释放到培养基中，再将15毫升的冷DMEM加入到培养皿中，以获得其余的细胞。

然后通过100微米细胞过滤器将组织浆料过滤到50毫升的冰上锥形管中。要分离原发小鼠肝细胞，通过离心收集细胞，并在10毫升新鲜DMEM中重新供应颗粒。小心地将细胞分层到 40% 密度梯度缓冲区上，进行密度梯度分离，在离心后将细胞从上层和中层丢弃。

用两到三毫升的威廉中 E 重新填充原发性白细胞颗粒，以避免从管壁收集死细胞，将细胞转移到新的 50 毫升管中。在离心前，将细胞与威廉E介质的另外7至8毫升混合，然后根据颗粒的大小，将颗粒重新在10、20或30毫升的新鲜威廉的中量E中重新下水。经过计数，种子六倍十至第五细胞到每井的六井板，在37摄氏度下孵育2至3小时。

在孵化结束时，用DMEM代替用10%胎儿牛血清和抗药剂补充的介质，取出死亡和未连接的细胞，并在夜间将细胞返回到培养箱。对于经过azide修改的新生蛋白质标签，在50微升2X反应缓冲液中加入20至40微克细胞酸盐。将体积与蒸馏去维化水一起带到 80 微升，并旋转蛋白质溶液五秒钟。

将五微升硫酸铜加入细胞，再产生5秒的涡流，然后是5微升的反应缓冲液添加剂，一个，5秒的涡旋。经过三分钟的孵育，在细胞中加入10微升重组反应缓冲液添加剂2个，再产生5秒的涡流，并在4摄氏度的高温下在多旋转机上旋转样品20分钟，不受光线影响。在旋转结束时，在酸盐中加入300微升甲醇，然后是75微升氯仿，200微升为双蒸馏水。

通过离心收集标记的蛋白质，并在颗粒中加入250微升新鲜甲醇。涡旋后，再次离心，在室温下用无绒组织覆盖裸露的颗粒15分钟。对于 PAGE 分析，将干燥的颗粒溶解在 20 微升的装载缓冲液中，无需 β-墨卡托乙醇，并旋转颗粒 10 分钟。

接下来，在70摄氏度的热块中加热蛋白质10分钟，将样品加载到10%的硫酸钠凝胶上，用于四甲基多胺胺检测。然后使用可变模式激光扫描仪精确定量AHA标记的新生蛋白质。从组织学上看，活体和附着原发性肝细胞在24小时培养后，通常以多边形或六边形出现，具有清晰勾勒的生物学边界。

为了确认分离的细胞是否是原发性肝细胞，本实验中，比较了小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠肝病细胞系、分离原发性小鼠肝细胞和小鼠肝脏中的白蛋白表达水平。白蛋白表达在原发小鼠肝细胞和小鼠肝脏中检测，但在小鼠胚胎成纤维细胞或肝细胞系细胞中检测不出。使用 10 微摩尔 Rotenone 进行初级肝细胞治疗 4 至 6 小时，揭示了肝安培-激活蛋白激酶的强健诱导，通过肝性 AMP-活性蛋白激酶 T172 的磷酸化水平检测出，与体内观察到的相似。

事实上，与未治疗的对照细胞相比，5小时的10微摩尔Rotenone治疗对治疗中原发性肝细胞的新生蛋白质合成有深刻的抑制作用，如化学糖分结反应测定所证明的。在尝试此过程时，必须记住提前准备所有必需的试剂和介质。这项技术为肝代谢病理生理学领域的研究人员探索分离的原发性小鼠肝细胞中肥胖和二型糖尿病能量蛋白调控的分子机制铺平了道路。