Bu yöntem, oosit olgunlaşması sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurları tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. In-vitro oosit olgunlaşması boyunca muhabir birikimini değerlendirmek için zaman atlamalı mikroskopi uyguladık. Bu, oosit olgunlaşması sırasında çevirisel aktivasyonun veya baskının gerçekleştiği zamanı doğru bir şekilde tespit eder.
Başlamak için, 26 kalibrelik bir iğne ile folikül duvarında küçük bir kesim yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağızla çalışan bir cam pipet kullanarak birkaç kat kümülüs hücresi ile bozulmamış COC'leri izole edin. Daha küçük bir pipet kullanın ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak denude edin.
Denuded oositleri epire edin ve bir mikromolar cilostamid ile desteklenmiş olgunlaşma ortamına sahip bir petri kabına yerleştirin. Oositlerin foliküllerden izole edilmesinin neden olduğu stresten kurtulması için yemeği iki saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Enjeksiyon iğneleri hazırlamak için mekanik bir çekme makinesine 10 santimetre uzunluğunda borosilikat cam kılcal boru yerleştirin.
En iyi enjeksiyon için ısıtılmış bir filament kullanarak iğne ucunu 45 derecelik bir açıyla bükün. Temel oosit toplama ortamının 20 mikroliter damlacığını bir polistiren kabına yerleştirin ve damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün. Her biri Ypet UTR ve mCherry mikroliteri başına 12,5 mikrogram ekleyerek daha büyük hacimli bir muhabir karışımı hazırlayın.
Bunlardan aliquots eksi 80 santigrat derecede saklayın. Çözdükten sonra, aliquot'ı 20.000 kez G'de iki dakika santrifüjleyin, ardından yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Enjeksiyon iğnesini yaklaşık 0,5 mikrolitre muhabir karışımı ile yükleyin.
Tutma pipetini ve enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve oosit toplama ortamının damlacığı içine yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini tutma pipetine hafifçe dokunarak açın. Oositleri temel toplama ortamının bir damlasına yerleştirin ve muhabir karışımının beş ila 10 pişolitresini enjekte edin.
mCherry sinyalinin platoya girmesine izin vermek için oositleri ve olgunlaşma ortamını 16 saat boyunca bir mikromoler cilostamid ile kuluçkaya bırakın. Zaman atlamalı mikroskopi için, enjekte edilen her muhabir için iki adet 20 mikroliter olgunlaşma ortamı damlacıklı bir Petri kabı, profaz I-arrested oositleri kontrol etmek için bir mikromolar cilostamidli bir damlacık ve olgunlaşan oositler için cilostamid içermeyen bir damlacık hazırlayın. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.
Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve cilostamid olmadan olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Bazı oositleri olgunlaşma ortamında bir mikromoler cilostamid ile profaz I oosit kontrol grubu olarak tutun. Enjekte edilen oositleri daha önce hazırlanmış zaman atlamalı mikroskop kabındaki ilgili damlacıklarına aktarın.
Kayıt sırasında hareketlerini önlemek için oositleri kapalı bir cam pipetle kümeleyin. Metnin el yazmasında belirtilen parametreleri kullanarak, çanağı ışık yayan diyot eliminasyon sistemi ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte tutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin. Uygulamalar'a ve ardından Çok Boyutlu Edinme'ye tıklayarak zaman atlamalı deneme için uygun ayarları girin.
İlk sekme Ana'yı seçin ve zaman atlamalı, birden çok aşama konumu ve birden çok dalga boyu seçin. Denemenin kaydedileceği konumu girmek için Kaydetme sekmesini seçin. Ardından, zaman noktası, süre ve zaman aralığı sayısını girmek için Zaman Atlama sekmesini seçin.
Yeni bir pencere açıp Canlı Al, Al ve Göster'i seçerek Sahne Alanı sekmesini seçin, brightfield'ı açın ve oositlerin konumunu bulun. Oositler bulunduktan sonra, çok boyutlu alım penceresine geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için artı tuşuna basın. Dalga Boyları sekmesini seçin ve brightfield, YFP ve mCherry için üç farklı dalga boyu ayarlayın.
Ypet ve mCherry için pozlamayı ayarlayın, ardından Acquire'e tıklayarak zaman atlamalı denemeyi başlatın. Ypet üç asal UTR çevirisinin analizi için, her oosit için iki bölge ölçümü, elips bölgesine tıklayarak oosit kendisi ve dikdörtgen bölgeye tıklayarak arka plan çıkarma için kullanılacak oosit'i çevreleyen küçük bir bölge gerçekleştirin. Günlüğü Aç'ı ve ardından Verileri Günlüğe Kaydet'i tıklatarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin.
Her bir oosit ve ölçülen tüm zaman noktaları için, arka plan bölgesi ölçümünü YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı oosit bölgesi ölçümünden çıkarın. Profaz I ve olgunlaşan oositlerde mCherry ve YFP ifadesi 39 oositte kaydedilmiş, bunlardan 30'u olgunlaşmış ve dokuzu profaz I'de negatif kontrol olarak tutuklanmıştır. Profaz I-arrested ve olgunlaşan oositlerin sinyalleri için bireysel YFP ila mCherry oranları, YFP sinyalini profaz I-arrested ve olgunlaşan oositler için son 10 zaman noktasının ortalama mCherry sinyaline bölerek enjekte edilen hacim için düzeltildi.
Muhabir YFP'nin çeviri oranları, YFP'yi profaz I'deki mCherry oranlarına uyan eğri ile ve ilk sıfır ila iki saat boyunca veya doğrusal regresyon kullanılarak cilostamid salınımı sonrası sekiz ila 10 saat boyunca olgunlaşan oositlerde ölçüldü. Muhabirin birikimi, cilostamid salınımı sonrası sıfır ila iki saat ile sekiz ila 10 saat arasındaki çeviri oranlarında önemli bir farkla belirtildiği gibi doğrusal bir desen izlemez, bu da oksilat miyotik olgunlaşma sırasında interlökin 7 çevirisinin aktivasyonunu gösterir. Bu protokolü denerken, kaydın başında pozlama süresinin yeterli olduğundan emin olun.
Oosit meiotik yeniden başlaması sırasında çeviri etkinleştirilirse sinyalin zaman kursu sırasında doyabileceğini unutmayın. MRMA'nın stabilitesi, YFP için astarlar kullanılarak PCR ile doğrulanabilir. Çevirideki değişiklikleri onaylamak için, Batı şişkinliğini bir V5 teknolojisine karşı bir antikorla kullanabilirsiniz.
