Этот метод может быть использован для выявления и характеристики регуляторных элементов, контролирующих трансляцию во время созревания ооцитов. Мы применили покадровую микроскопию для оценки накопления репортеров на протяжении созревания ооцитов in vitro. Это точно определяет время, когда трансляционная активация или репрессия происходит во время созревания ооцитов.
Для начала осторожно откройте антральные фолликулы, сделав небольшой разрез в стенке фолликула иглой 26 калибра. Изолируйте неповрежденные КОК с несколькими слоями кучевых клеток с помощью стеклянной пипетки, управляемой ртом. Используйте пипетку меньшего размера и механически обнажить КОК путем повторного пипетирования.
Аспирировать оголенные ооциты и поместить их в чашку Петри со средой созревания, дополненной одним микромоляром цилостамида. Поместите блюдо в инкубатор на два часа, чтобы яйцеклетки оправились от стресса, вызванного их выделением из фолликулов. Поместите боросиликатную стеклянную капиллярную трубку длиной 10 сантиметров в механический съемник для приготовления инъекционных игл.
Согните наконечник иглы под углом 45 градусов, используя нагретую нить для оптимальной инъекции. Поместите 20 микролитровых капель основной среды сбора ооцитов в полистирольная посуду и накройте капли легким минеральным маслом. Приготовьте больший объем репортерной смеси, добавив по 12,5 мкг на микролитр Ypet UTR и mCherry каждый.
Храните их аликвоты при минус 80 градусах Цельсия. После оттаивания центрифугируют аликвотку в течение двух минут при 20 000 G, затем переложите ее на новую микроцентрифужную трубку. Загрузите инъекционную иглу примерно 0,5 микролитра репортерной смеси.
Поместите удерживающая пипетку и инъекционную иглу в держатели и поместите их в каплю среды сбора ооцитов. Откройте инъекционную иглу, осторожно постукивая ею по удерживающей пипетке. Поместите ооциты в каплю основной среды сбора и ввести от пяти до 10 пиколитров репортерной смеси.
Инкубируют ооциты и среду созревания одним микромолярным цилостамидом в течение 16 часов, чтобы сигнал mCherry вышел на плато. Для покадровой микроскопии приготовьте чашку Петри с двумя 20 микролитрами капли среды созревания для каждого введенного репортера, одной каплей с одним микромолярным цилостамидом для контроля профазных I-арестованных ооцитов и одной каплей без цилостамида для созревания ооцитов. Накройте капли легким минеральным маслом и поместите их в инкубатор.
После предварительной инкубации удаляют введенные ооциты из инкубатора и промывают их четыре раза в среде созревания без цилостамида. Держите некоторые ооциты в среде созревания с помощью одного микромолярной цилостамида в качестве профазы I контрольной группы ооцитов. Перенесите введенные ооциты в соответствующие капли на предварительно подготовленной тарелке для покадрового микроскопа.
Сгруппировать ооциты с помощью закрытой стеклянной пипетки, чтобы предотвратить их движение во время записи. Поместите тарелку под микроскоп, оснащенный системой устранения светодиодов и моторизованной ступенью, оснащенной экологической камерой, поддерживаемой при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, используя параметры, указанные в текстовой рукописи. Введите соответствующие параметры для эксперимента с замедленной съемкой, щелкнув Приложения, а затем Многомерное получение.
Выберите первую вкладку Главная и выберите покадровую съемку, несколько положений ступеней и несколько длин волн. Выберите вкладку Сохранение, чтобы ввести место, где должен быть сохранен эксперимент. Затем выберите вкладку Time-Lapse, чтобы ввести количество точек времени, продолжительность и интервал времени.
Выберите вкладку Рабочая область, включите brightfield и найдите положение ооцитов, открыв новое окно и выбрав Получить, Получить и Показать в реальном времени. Как только ооциты будут расположены, переключитесь обратно в многомерное окно сбора и нажмите плюс, чтобы установить местоположение ооцитов. Выберите вкладку Длины волн и задайте три разные длины волн для brightfield, YFP и mCherry.
Отрегулируйте экспозицию для Ypet и mCherry, затем запустите эксперимент с покадровой съемкой, нажав на «Получить». Для анализа трансляции Ypet три основных UTR выполните два измерения области для каждой яйцеклетки, саму яйцеклетку, щелкнув по области эллипса, и небольшую область, окружающую ооцит, которая будет использоваться для фонового вычитания, щелкнув прямоугольную область. Экспортируйте данные измерения региона в электронную таблицу, щелкнув Открыть журнал, а затем Данные журнала.
Для каждой отдельной яйцеклетки и для всех измеренных временных точек вычтите измерение фоновой области из измерения области ооцитов отдельно для длин волн YFP и mCherry. Экспрессия mCherry и YFP в профазных I и созревающих ооцитах была зарегистрирована в 39 ооцитах, из которых 30 были зрелыми, а девять были арестованы в профазе I в качестве отрицательного контроля. Индивидуальные соотношения YFP к mCherry для сигналов профазных I-арестованных и созревающих ооцитов корректировали на вводимый объем путем деления сигнала YFP на средний сигнал mCherry последних 10 временных точек для профазных I-арестованных и созревающих ооцитов.
Скорость трансляции репортерного YFP измеряли кривой, подгоняющей отношение YFP к mCherry в профазе I и в созревающих ооцитах в течение первых нулевых-двух часов или от восьми до 10 часов после высвобождения цилостамида с использованием линейной регрессии. Накопление репортера не следует линейной схеме, о чем свидетельствует значительная разница в скорости трансляции от нуля до двух часов и от восьми до 10 часов после высвобождения цилостамида, что указывает на активацию трансляции интерлейкина 7 во время созревания миоций ооцитов. При попытке этого протокола убедитесь, что время экспозиции является достаточным в начале записи.
Имейте в виду, что сигнал может насыщаться во время временного курса, если трансляция активируется во время мейотического возобновления ооцитов. Стабильность МРМА может быть подтверждена ПЦР, с использованием праймеров для YFP. Чтобы подтвердить изменения в переводе, вы можете использовать вестерн-блоттинг с антителом против технологии V5.
