이 방법은 난모세포 성숙 시 번역을 제어하는 규제 요소를 식별하고 특성화하는 데 사용될 수 있습니다. 시험관 내 난해성 전반에 걸쳐 기자 축적을 평가하기 위해 시간 경과 현미경 검사를 적용했습니다. 이것은 정확하게 번역 활성화 또는 억압이 oocyte 성숙 도중 일어나는 시간을 정확하게 찾아내습니다.
시작하려면 26 게이지 바늘로 여포 벽에 작은 절단을 함으로써 개미 여포를 조심스럽게 엽니다. 입으로 작동하는 유리 파이펫을 사용하여 여러 층의 적혈구로 손상되지 않은 COC를 분리합니다. 더 작은 파이펫을 사용하고 반복 파이프팅을 통해 COC를 기계적으로 디누드합니다.
탈모한 난토를 흡입하고 시트로스타미드의 마이크로몰라 1장으로 보충된 성숙 매체를 곁들인 페트리 접시에 넣습니다. 난모세포가 여포로부터의 고립으로 인한 스트레스로부터 회복될 수 있도록 2시간 동안 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 10센티미터 길이의 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 기계 풀러에 넣고 주사 바늘을 준비합니다.
최적의 주사를 위해 가열 된 필라멘트를 사용하여 45도 각도로 바늘 끝을 구부립니다. 폴리스티렌 접시에 기본 oocyte 수집 매체의 20 마이크로 리터 방울을 놓고, 가벼운 미네랄 오일로 방울을 덮습니다. Ypet UTR및 mCherry각각의 마이크로리터 당 12.5 마이크로그램을 추가하여 더 많은 양의 리포터 믹스를 준비합니다.
영하 80도에 이들의 알리쿼트를 보관하십시오. 해동시 알리쿼트(aliquot)를 20, 000회 G로 2분간 원심분리한 다음 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮긴다. 기자 믹스의 약 0.5 마이크로 리터로 주사 바늘을적재한다.
홀더에 홀딩 파이펫과 주입 바늘을 놓고 오피테 수집 매체의 액적에 놓습니다. 조심스럽게 보유 파이펫에 대해 눌러 주입 바늘을 엽니 다. 보낭을 기본 수집 매체의 액적에 놓고 리포터 믹스의 5~10피콜리터를 주입합니다.
16시간 동안 1개의 마이크로몰러 시로사미드로 난모세포와 성숙 배지를 배양하여 mCherry 신호를 고원에 허용합니다. 시간 경과 현미경 검사법의 경우, 각 주입 된 기자에 대한 성숙 배지의 20 마이크로 리터 방울, 제어 prophase I-체포 oocytes를위한 마이크로 몰러 cilostamide 1 방울, 성숙 난모를위한 시로스타미드가없는 한 방울로 페트리 접시를 준비하십시오. 경광물 오일로 물방울을 덮고 인큐베이터에 넣습니다.
사전 인큐베이션 후 인큐베이터에서 주입 된 난모세포를 제거하고 cilostamide없이 성숙 배지에서 4 번 세척하십시오. 1개의 마이크로몰러 cilostamide를 프로페이즈 I oocyte 대조군으로 성숙 배지에 일부 난토를 보관하십시오. 이전에 준비된 시간 경과 현미경 접시에 주입된 난모세포를 각각의 물방울로 옮깁니다.
녹음 중에 움직임을 방지하기 위해 밀폐 된 유리 파이펫으로 난모를 클러스터합니다. 텍스트 원고에 언급된 매개변수를 사용하여 식기 방출 다이오드 제거 시스템과 환경 챔버가 장착된 전동 단계는 텍스트 원고에 언급된 매개변수를 사용하여 37도 및 이산화탄소 5%로 유지되는 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 앱을 클릭한 다음 다차원 인수를 클릭하여 시간 경과 실험에 적합한 설정을 입력합니다.
첫 번째 탭 Main을 선택하고 시간 경과, 여러 스테이지 위치 및 여러 파장을 선택합니다. 탭 저장을 선택하여 실험을 저장해야 하는 위치를 입력합니다. 그런 다음 탭 Time-Lapse를 선택하여 시간 점, 기간 및 시간 간격을 입력합니다.
탭 스테이지를 선택하고, 밝은 필드를 전환하고, 새 창을 열고 획득, 획득 및 라이브 표시를 선택하여 난모세포의 위치를 찾습니다. 난모세포가 있는 후에는 다차원 획득 창으로 돌아가 서 플러스를 눌러 난모세포의 위치를 설정합니다. 탭 파장을 선택하고 밝은 필드, YFP 및 mCherry에 대한 세 가지 다른 파장을 설정합니다.
Ypet 및 mCherry에 대한 노출을 조정한 다음 획득을 클릭하여 시간 경과 실험을 시작합니다. Ypet 3개의 주요 UTR 번역을 분석하기 위해 각 난소에 대해 두 개의 영역 측정, 타원 영역을 클릭하여 난소 세포 자체, 직사각형 영역을 클릭하여 배경 감산에 사용할 난모세포 주변의 작은 영역을 수행합니다. 리전 측정 데이터를 열기 로그를 클릭한 다음 데이터를 기록하여 스프레드시트로 내보냅니다.
각 개별 난소 및 측정된 모든 시간점에 대해 YFP 및 mCherry 파장에 대해 별도로 난낭 영역 측정에서 백그라운드 영역 측정을 뺍니다. mCherry와 YFP의 발현은 39개의 난초로 기록되었으며, 그 중 30개가 성숙되었고, 9명은 부정적 통제로 1단계에서 체포되었다. Prophase I-체포 및 성숙 난귀세포의 신호에 대한 개별 YFP 대 mCherry 비율은 Prophase I-체포 및 성숙 난모세포에 대한 마지막 10 시간 지점의 평균 mCherry 신호로 YFP 신호를 분할하여 주입 된 부피에 대해 수정되었다.
기자 YFP의 번역률은 YFP대 mCherry 비율을 prophase I에서 피팅하고, 첫 0~2시간 동안, 또는 선형 회귀를 사용하여 시로사다미드 방출 후 8~10시간 동안 성숙한 난귀에 의해 측정되었다. 리포터의 축적은 시로스타미드 방출 후 0~2시간에서 8~10시간 사이의 번역률의 현저한 차이로 표시된 선형 패턴을 따르지 않으며, 이는 난소근 성숙 시 인터류키닌 7 번역의 활성화를 나타낸다. 이 프로토콜을 시도할 때 기록 시작 시 노출 시간이 적절한지 확인합니다.
오키테 메이오틱 재개 중에 번역이 활성화되면 시간 과정에서 신호가 포화될 수 있습니다. MRMA의 안정성은 YFP에 대한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인될 수 있다. 번역의 변화를 확인하려면 V5 기술에 대한 항체로 서양 얼룩을 사용할 수 있습니다.
