Este método pode ser usado para identificar e caracterizar elementos regulatórios que controlam a tradução durante a maturação do oócito. Aplicamos microscopia de lapso de tempo para avaliar o acúmulo de repórteres durante a maturação in vitro oócito. Isso identifica com precisão o momento em que a ativação ou repressão translacional ocorre durante a maturação do oócito.
Para começar, abra cuidadosamente os folículos antrais fazendo um pequeno corte na parede do folículo com uma agulha calibre 26. Isole COCs intactos com várias camadas de células cumulus usando uma pipeta de vidro operada pela boca. Use uma pipeta menor e desnuda mecanicamente os COCs por pipetação repetida.
Aspire os oócitos desnudos e coloque-os em uma placa de petri com meio de maturação suplementado com um micromolar de cilostamida. Coloque o prato em uma incubadora por duas horas para deixar os oócitos se recuperarem do estresse induzido pelo isolamento dos folículos. Coloque um tubo capilar de vidro borossilicato de 10 centímetros de comprimento em um puxador mecânico para preparar agulhas de injeção.
Dobre a ponta da agulha em um ângulo de 45 graus usando um filamento aquecido para uma injeção ideal. Coloque 20 gotículas de microliter de meio básico de coleta de oócito em um prato de poliestireno, e cubra as gotículas com óleo mineral leve. Prepare um volume maior de mistura de repórter adicionando 12,5 microgramas por microliter de Ypet UTR e mCherry cada.
Armazene alíquotas destes a menos 80 graus Celsius. Após descongelar, centrifugar a alíquota por dois minutos a 20.000 vezes G, em seguida, transfira-a para um novo tubo de microcentrifuagem. Carregue a agulha de injeção com aproximadamente 0,5 microliters de mistura de repórter.
Coloque a pipeta de retenção e a agulha de injeção nos suportes e posicione-as na gota do meio de coleta de oócito. Abra a agulha de injeção batendo suavemente contra a pipeta de retenção. Coloque oócitos em uma gota de meio de coleta básica e injete de cinco a dez picoliters da mistura de repórteres.
Incubar os oócitos e o meio de maturação com uma cilostamida micromolar por 16 horas para permitir que o sinal mCherry planar. Para microscopia de lapso de tempo, prepare uma placa de Petri com duas gotículas de 20 microliter de meio de maturação para cada repórter injetado, uma gota com uma cilostamida micromolar para oócitos de prophase de controle I-preso, e uma gota sem cilostamida para oócitos maduros. Cubra as gotículas com óleo mineral leve e coloque-as na incubadora.
Após a pré-incubação, remova os oócitos injetados da incubadora e lave-os quatro vezes em meio de maturação sem cilostamida. Mantenha alguns oócitos em meio de maturação com uma cilostamida micromolar como um grupo de controle de oócitos prophase I. Transfira os oócitos injetados para suas respectivas gotículas no prato de microscópio de lapso de tempo previamente preparado.
Aglomerado os oócitos com uma pipeta de vidro fechada para evitar seu movimento durante a gravação. Coloque o prato sob o microscópio equipado com um sistema de eliminação de diodo emissor de luz e um estágio motorizado equipado com uma câmara ambiental mantida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, utilizando os parâmetros mencionados no manuscrito do texto. Digite as configurações apropriadas para o experimento de lapso de tempo clicando em Aplicativos e, em seguida, Aquisição Multidimensional.
Selecione a primeira guia Principal e selecione time-lapse, várias posições de estágio e vários comprimentos de onda. Selecione a guia Salvar para inserir o local onde o experimento deve ser salvo. Em seguida, selecione a guia Time-Lapse para inserir o número de pontos de tempo, duração e intervalo de tempo.
Selecione a guia Estágio, ligue em brightfield e localize a posição dos oócitos abrindo uma nova janela e selecionando Acquire, Acquire e Show Live. Uma vez localizados os oócitos, volte para a janela de aquisição multidimensional e pressione mais para definir a localização dos oócitos. Selecione os comprimentos de onda da guia e defina três comprimentos de onda diferentes para brightfield, YFP e mCherry.
Ajuste a exposição para Ypet e mCherry e inicie o experimento de lapso de tempo clicando em Acquire. Para análise da tradução UTR Ypet três prime, realize duas medidas de região para cada oócito, o oócito em si clicando na região da elipse e uma pequena região ao redor do oócito para ser usada para subtração de fundo clicando na região retangular. Exporte os dados de medição da região para uma planilha clicando em Abrir log e, em seguida, Log Data.
Para cada oócito individual e para todos os pontos de tempo medidos, subtraia a medição da região de fundo da medição da região do oócito separadamente para comprimentos de onda YFP e mCherry. A expressão de mCherry e YFP em prophase I e oócitos maduros foi registrada em 39 oócitos, dos quais 30 foram amadurecidos, e nove foram presos em prophase I como um controle negativo. As razões individuais de YFP para mCherry para sinais de oócitos prophase I-arrested e maturação foram corrigidas para volume injetado dividindo o sinal YFP pelo sinal mCherry médio dos últimos 10 pontos de tempo para prophase I-arrested e oócitos maduros.
As taxas de tradução do repórter YFP foram medidas pela curva que encaixa as relações YFP para mCherry em prophase I e em oócitos maduros durante as primeiras zero a duas horas, ou oito a 10 horas após a liberação de cilostamida usando regressão linear. O acúmulo do repórter não segue um padrão linear, como indicado por uma diferença significativa nas taxas de tradução entre zero a duas horas e oito a 10 horas após a liberação da cilostamida, indicando ativação da tradução interleucina 7 durante a maturação miótica oócicl. Ao tentar este protocolo, certifique-se de que o tempo de exposição seja adequado no início da gravação.
Tenha em mente que o sinal pode saturar durante o curso de tempo se a tradução for ativada durante a retomada meiotica oócito. A estabilidade do MRMA pode ser confirmada pelo PCR, utilizando primers para YFP. Para confirmar mudanças na tradução, você pode usar manchas ocidentais com um anticorpo contra uma tecnologia V5.
