A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é uma medida de resultado fundamental na pesquisa da doença de Parkinson. Este protocolo encurta significativamente a carga de trabalho necessária para estimar o número do neurônio. Este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e é adequado para determinar o efeito das intervenções na sobrevivência celular.
Este método poderia ser facilmente adaptado para fornecer contagem precisa de neurônios em diferentes regiões cerebrais, mantendo vantagens de custo e tempo sobre os métodos eseológicos tradicionais. Para capturar imagens IHC use o software acoplado a um microscópio confocal na ampliação de 10X. Abra o orifício de pinos para 1,5 unidades de área para capturar um plano largo totalizando 1,5 micro metros e definir o foco no lado injetado do cérebro.
Na guia de aquisição verifique a opção de imagem de varredura de ladrilhos e defina as dimensões para 10 por quatro. Sob o painel do modo de aquisição, ajuste o zoom para 1.1 para evitar qualquer marca de costura entre as imagens de varredura de ladrilhos. Defina o tamanho do quadro para 1024 por 1024 pixels e a média de dois para garantir a aquisição de imagem de alta qualidade.
No painel de canais definir faixa um para Alexa 488 e faixa dois para Alexa 555. Carregue o slide no palco e escolha uma seção com uma mancha th forte. Clique ao vivo no painel de aquisição.
No painel de canais, defina a força do laser e ganhe níveis que maximizem o sinal e limitem o ruído de fundo. Use o indicador de intervalo para garantir que os sinais não sejam superexpostos. Repita isso com vários slides.
Na guia de aquisição verifique a caixa de posições. Para começar a imagem, use a peça ocular e escolha a primeira seção mostrando manchas th positivas. Em seguida, coloque o foco no ponto de interesse e mova o palco para a linha central da seção.
Isso salva a posição nos eixos X, Y e Z e irá visualizar uma varredura de ladrilhos capturando toda a seção. Repita isso para todos os outros slides, incluindo um site não injetado. Separar arquivos de imagem usando software apropriado e importá-los para software automatizado de análise de imagens.
Defina uma região de interesse selecionando a ferramenta de anotação da caneta para desenhar uma anotação em torno da substantia nigra pars compacta. Mova-se para a guia de análise e selecione a sintonia em tempo real no menu de análise suspensa. Isso abre uma janela separada na imagem da seção permitindo a modificação em tempo real dos parâmetros de análise.
Na seção de ampliação da análise selecione o zoom de imagem apropriado. Sob a seção de detecção de células selecione corante nuclear como o corante usado para coloração th. Ajuste o limiar de contraste nuclear, intensidade nuclear mínima, agressividade da segmentação nuclear e configurações de tamanho nuclear enquanto observe cuidadosamente a janela de ajuste do tempo.
Repita este processo com várias amostras. Uma vez que um número apropriado de imagens tenha sido amostrado e a sintonia em tempo real tenha sido ajustada de acordo, salve as configurações de análise no menu suspenso das ações de configurações. Selecione todas as imagens a serem analisadas e clique em analisar.
Escolha a configuração de análise que acabou de ser salva e na janela de análise verifique a caixa de camadas de anotação e, em seguida, marque a camada um e clique em analisar. Uma vez completa a exportação dos dados de análise de resumo para todas as seções, selecionando a opção de exportar dados de análise de objetos. Este conjunto de dados poderia ser usado para examinar alterações no tamanho da célula em resposta a uma toxina ou terapêutica.
Seis semanas após as injeções de adeno associadas ao vírus ou AAV, a injeção estereotática de AAV expressando synucleína alfa mutante A53T na substantia nigra no cérebro de rato resultou em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos. O número médio de neurônios th positivos por milímetro ao quadrado na substantia nigra de ratos injetados com AAV-A35T foi significativamente diminuído em comparação com o de ratos injetados com o vetor vazio AAV. Observações semelhantes foram feitas usando estereologia imparcial.
Ao tentar este protocolo tenha em mente que o software é tão útil quanto é treinado para ser. Portanto, o tempo e o cuidado devem ser tomados para garantir que uma única célula seja identificada como uma única célula. O software pode ser adaptado para medir uma intensidade de fluorescência de outras proteínas de interesses como a alfa-sinucleína para determinar se os tratamentos podem modular os níveis de proteína.
Esta técnica permitiu maior eficiência ao testar o efeito de múltiplas terapêuticas potenciais na densidade dopaminérgica do neurônio.
